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新虫 (初入文坛)

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[求助] 兼并引物PCR连T载体后，怎么鉴定有没有连上

我用简并引物扩一段未知序列，扩出来后连T载体，怎么鉴定有没有连上呢，不能用简并引物去扩吧，酶切的话不知道目的序列的酶切位点情况，只能选几个试试，但效果都不理想啊，这一时半会也不知上哪去找通用引物，怎么办呢，急！

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1楼 2011-07-21 22:42:55

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冼亮淀粉酶

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【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): 替代染料是啥啊 2011-07-23 01:37:33

引用回帖:

Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-22 20:17:07:
5ng是不是能看清楚要看EB是什么时候加的以及条带的大小，如果EB是在配胶的时候加进去的，那么在跑电泳的时候，EB的泳动方向与DNA泳动方向是相反的，如果条带比较小的话，5ng的量是不容易看清楚的。mark最亮的一 ...

EB是有毒物质，我们实验室从不把它加到电泳槽里，只设置专门的染缸来染色，染缸放置在黑暗密闭处。建议你也别把EB放在开放的地方。

条带的大小跟显影亮度无关，有关的只是含量。即使条带很大，达到10kb，含量很少，亮度也不大。即使条带只有1kb，但是含量够多，亮度也会较大。所以，EB染色时候是ng（纳克）决定亮度，不是kb（片段长度）。

DNA Ladder的生产厂家是不同的，生产的条带也有一些区别。你说“mark最亮的一条带一般是20ng/ul”，但是我看到的说明书上写的是“23%”，用的是百分比，意思是这一条带占所有的条带总和的含量。是相对含量，而不是绝对含量。绝对含量是可以计算出来的，我们实验室的1kb DNA Ladder内DNA浓度是25ng/ul，每次电泳取4ul，那么最亮的一条带就是23ng。

现在我们实验室已经不用EB，换用替代染料了，这个替代染料是大势所趋。