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380665135

新虫 (初入文坛)

[求助] 兼并引物PCR连T载体后，怎么鉴定有没有连上

我用简并引物扩一段未知序列，扩出来后连T载体，怎么鉴定有没有连上呢，不能用简并引物去扩吧，酶切的话不知道目的序列的酶切位点情况，只能选几个试试 ，但效果都不理想啊，这一时半会也不知上哪去找通用引物，怎么办呢，急！
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1楼 2011-07-21 22:42:55
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-07-22 08:18:15
试着跑一个电泳，PCR产物是一条带，T载体也是一条带，连接成功的是另一条带，但是要求DNA较多，连接体系不至于跑了电泳就用完了。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-07-22 07:28:06
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
西瓜(金币+1): 鼓励 2011-07-22 11:55:16
目的序列的酶切位点可以用软件查找的
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4楼2011-07-22 08:34:49
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-22 10:37:01:
关于没连上的问题：
（1）确定你扩增片段时是用的Taq酶而不是高保真的pfu之类的酶，原因你懂得
（2）PCR片段扩完后一定要割胶回收后再拿去做连接
（3）如果连转做的不熟的话建议看一下我在小木虫上发的帖子[ur ...

PCR产物是一条带，T载体也是一条带，连接成功的是另一条带。T载体肯定是线性的，也有带，但是跑胶的时候与连接成功的产物不一定重合。
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14楼2011-07-22 18:30:05
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
至于跑胶要多少，得取决于样品有多少，但至少在电泳的时候5纳克看起来是很清楚的。
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15楼2011-07-22 18:33:01
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): 替代染料是啥啊 2011-07-23 01:37:33
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-22 20:17:07:
5ng是不是能看清楚要看EB是什么时候加的以及条带的大小，如果EB是在配胶的时候加进去的，那么在跑电泳的时候，EB的泳动方向与DNA泳动方向是相反的，如果条带比较小的话，5ng的量是不容易看清楚的。mark最亮的一 ...

EB是有毒物质，我们实验室从不把它加到电泳槽里，只设置专门的染缸来染色，染缸放置在黑暗密闭处。建议你也别把EB放在开放的地方。

条带的大小跟显影亮度无关，有关的只是含量。即使条带很大，达到10kb，含量很少，亮度也不大。即使条带只有1kb，但是含量够多，亮度也会较大。所以，EB染色时候是ng（纳克）决定亮度，不是kb（片段长度）。

DNA Ladder的生产厂家是不同的，生产的条带也有一些区别。你说“mark最亮的一条带一般是20ng/ul”，但是我看到的说明书上写的是“23%”，用的是百分比，意思是这一条带占所有的条带总和的含量。是相对含量，而不是绝对含量。绝对含量是可以计算出来的，我们实验室的1kb DNA Ladder内DNA浓度是25ng/ul，每次电泳取4ul，那么最亮的一条带就是23ng。

现在我们实验室已经不用EB，换用替代染料了，这个替代染料是大势所趋。
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17楼2011-07-22 21:43:28
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
EB有毒，最好单独染，密闭避光。也不用考虑电泳时迁移的问题了。
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19楼2011-07-22 23:11:34
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