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[求助]
兼并引物PCR连T载体后，怎么鉴定有没有连上
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| 我用简并引物扩一段未知序列，扩出来后连T载体，怎么鉴定有没有连上呢，不能用简并引物去扩吧，酶切的话不知道目的序列的酶切位点情况，只能选几个试试 ，但效果都不理想啊，这一时半会也不知上哪去找通用引物，怎么办呢，急！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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2楼2011-07-22 07:28:06
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4楼2011-07-22 08:34:49
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14楼2011-07-22 18:30:05
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15楼2011-07-22 18:33:01
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【答案】应助回帖
1949stone(EPI+1): 替代染料是啥啊 2011-07-23 01:37:33
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EB是有毒物质，我们实验室从不把它加到电泳槽里，只设置专门的染缸来染色，染缸放置在黑暗密闭处。建议你也别把EB放在开放的地方。 条带的大小跟显影亮度无关，有关的只是含量。即使条带很大，达到10kb，含量很少，亮度也不大。即使条带只有1kb，但是含量够多，亮度也会较大。所以，EB染色时候是ng（纳克）决定亮度，不是kb（片段长度）。 DNA Ladder的生产厂家是不同的，生产的条带也有一些区别。你说“mark最亮的一条带一般是20ng/ul”，但是我看到的说明书上写的是“23%”，用的是百分比，意思是这一条带占所有的条带总和的含量。是相对含量，而不是绝对含量。绝对含量是可以计算出来的，我们实验室的1kb DNA Ladder内DNA浓度是25ng/ul，每次电泳取4ul，那么最亮的一条带就是23ng。 现在我们实验室已经不用EB，换用替代染料了，这个替代染料是大势所趋。 |
17楼2011-07-22 21:43:28
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19楼2011-07-22 23:11:34
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