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380665135新虫 (初入文坛)
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[求助]
兼并引物PCR连T载体后，怎么鉴定有没有连上
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| 我用简并引物扩一段未知序列，扩出来后连T载体，怎么鉴定有没有连上呢，不能用简并引物去扩吧，酶切的话不知道目的序列的酶切位点情况，只能选几个试试 ，但效果都不理想啊，这一时半会也不知上哪去找通用引物，怎么办呢，急！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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空谷幽风
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 学习了！ 2011-07-22 11:56:58
西瓜(金币+5, EPI+1): 学习了！ 2011-07-22 11:56:58
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关于没连上的问题： （1）确定你扩增片段时是用的Taq酶而不是高保真的pfu之类的酶，原因你懂得 （2）PCR片段扩完后一定要割胶回收后再拿去做连接 （3）如果连转做的不熟的话建议看一下我在小木虫上发的帖子http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2311683 关于酶切位点的问题：你酶切的目的是把T载体切成线性，跑胶看大小？难道你不知道T载体本身就是线性的！如果你做TA克隆的时候也把载体切完后用过的我就明白你为什么连转不成功了（T载体是直接可以拿来用的！） |
12楼2011-07-22 10:37:01
空谷幽风
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16楼2011-07-22 20:17:07
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18楼2011-07-22 23:06:23