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shadowerhua

新虫 (初入文坛)

[交流] 紧急求助 关于 PCR 无条带的问题,要奔溃啦 (请帮忙谢谢)已有2人参与

PCR 产物 电泳一直没有结果,没有特异性条带
可是 real time PCR (加了SYBR) melting curve 都是有很强的 单一峰值。理论上应该有特异性产物在电泳中, marker 很清晰的,换了几种 loading也一样的结果。 1% 的 琼脂糖胶,
电泳中是同一个样品做了一些稀释,50x,500X, 5000X 和10000x, DNA template 是来自于 T4 ligation的 酶切产物,所以模板理论上应该是 环状双链DNA,  引物是 合作者 设计的, 肯定没有问题,都发了CNS 了


具体见 图片。

Untitled.jpg



2013-01-28 19.24.51.jpg

[ Last edited by shadowerhua on 2013-1-29 at 15:54 ]
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zhang881007

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你的目标片段大约是多少?是否可以考虑加些DMSO减少高GC的影响
shine
2楼2013-01-29 16:10:00
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zhoulubin

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
为什么不拿Q-PCR的产物跑个电泳呢?
说不定是你普通PCR反应条件不适合,还有就是注意产物大小。
每个年龄都有其最应该做的事,但只有过了那个年龄自己才知道
3楼2013-01-30 10:49:57
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shadowerhua

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhang881007 at 2013-01-29 16:10:00
你的目标片段大约是多少?是否可以考虑加些DMSO减少高GC的影响

目的片段大小是不知道的,以为做的是 inverse PCR, 检查 mutation 的插入点的,
所以 删选出来的colony 提了g DNA, 然后酶切,然后T4 链接,所以DNA 模板是一些 环状 双联DNA, 然后 用一对 primer ( mutation vector ) 去PCR, 然后sequence。
4楼2013-01-30 13:20:19
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shadowerhua

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-01-30 10:49:57
为什么不拿Q-PCR的产物跑个电泳呢?
说不定是你普通PCR反应条件不适合,还有就是注意产物大小。

主要的目的就是得到一个未知大小的产物,然后去 seq ,最后再去map 处 vector 以外的 序列来自于哪个位置基因
5楼2013-01-30 13:21:27
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