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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 崩溃ing---PCR后无条带问题
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)

[求助] 崩溃ing---PCR后无条带问题

本人打算做T-RFLP，现在正在做土壤总细菌16S PCR，引物是27F和1492R，PCR体系（25ul）是：dNTP（10UM） 0.5ul, 引物（10UM）各1uL，Taq E 0.5ul，10×buffer缓冲液（5U/uL），模板0.5uL，以水补齐。PCR条件是94℃预变性5 min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5 min，35个循环，72℃下延伸10min。按照这个条件，无法P出条带。期间，也换过EB染色液、TAE，但问题依旧。大家帮忙分析一下是什么原因吧。
还有，用先前提取的大田土壤DNA可以P出来，但是用我前两天刚刚提取的室内土样DNA竟然无法P出。下面个给出两种DNA的具体参数：
土样   浓度     260       280      260/280     260/230  PCR情况
大田    65.4     1.307     0.757     1.73           0.89         可以P出
室内    59.6     1.192     0.680     1.75           0.25         无法P出
室内    60.9      1.218    0.711    1.71             1.16         无法P出
请大家帮忙看看，这是怎么回事啊 ？
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1楼2012-05-10 08:34:02
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回帖置顶 ( 共有1个 )

liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
西瓜: 回帖置顶 2012-05-12 23:34:54
引用回帖:
12楼: Originally posted by elbo at 2012-05-12 11:29:50:
找到志同道合的了，我也在做TRFLP。首先一般情况下DNA都需要纯化。反应体系配置过程一定要仔细，建议加大模板量。 PCR条件自己摸索还是拿的别人，另外 建议循环数减少到25,（据研究报道，减少循环数能够减少碱基错 ...

谢谢你的建议，这两天开始做出来了，很惊喜
加大模板量不一定行，我试过了
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13楼2012-05-12 12:57:37
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuxing1-1: 金币+2 2012-05-10 16:30:21
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-11 17:35:35
引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-05-10 11:36:18:
呵呵，个人浅见啊，我觉得是材料的问题，你要的是16s核糖体RNA，这个家伙是翻译蛋白用的，你室内的的土样肯定比大田活性低的多，你检测时的结果大概是混有DNA，反正不能保证完全是RNA，你可以参考一下，实验顺利啊

做16S一样可以从DNA开始的，不一定要提RNA再RT-PCR。16S rDNA这也不是什么新鲜概念了。

问LZ一个问题，你提完DNA就只测一个紫外就完了么？没有跑胶检测一下？DNA降解是可能的原因之一。另外，建议你做PCR的时候设置两个对照，阳性对照（确定能P出来的样本做模板）和阴性对照（无模板，补水），这样有利于分析结果，排除误差。
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4楼2012-05-10 15:07:33
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
14楼: Originally posted by elbo at 2012-05-12 19:34:56:
传授一下你的经验呗，怎么搞定的，

其实，我就是做了两套体系，体系2 的DNA浓度加倍而已，这样的情况下，大部分体系1 就能做出来，但是很少情况下，正好体系1 没做出来，但是体系2 竟然出条带了，所以，就这么配合着，都出来了
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16楼2012-05-13 10:23:30
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普通回帖

cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-10 13:51:30
liuxing1-1: 金币+1 2012-05-10 16:30:27
呵呵，个人浅见啊，我觉得是材料的问题，你要的是16s核糖体RNA，这个家伙是翻译蛋白用的，你室内的的土样肯定比大田活性低的多，你检测时的结果大概是混有DNA，反正不能保证完全是RNA，你可以参考一下，实验顺利啊
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我努力我奋斗我成功
2楼2012-05-10 11:36:18
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-05-10 11:36:18:
呵呵，个人浅见啊，我觉得是材料的问题，你要的是16s核糖体RNA，这个家伙是翻译蛋白用的，你室内的的土样肯定比大田活性低的多，你检测时的结果大概是混有DNA，反正不能保证完全是RNA，你可以参考一下，实验顺利啊

我提取的是土壤DNA啊，不是RNA
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3楼2012-05-10 11:47:33
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by holyala at 2012-05-10 15:07:33:
做16S一样可以从DNA开始的，不一定要提RNA再RT-PCR。16S rDNA这也不是什么新鲜概念了。

问LZ一个问题，你提完DNA就只测一个紫外就完了么？没有跑胶检测一下？DNA降解是可能的原因之一。另外，建议你做PCR的时 ...

今天刚跑了胶，有条带，但是不是非常清晰
是前两天刚提取的dna，不能降解吧
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5楼2012-05-10 16:29:14
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
引用回帖:
5楼: Originally posted by liuxing1-1 at 2012-05-10 16:29:14:
今天刚跑了胶，有条带，但是不是非常清晰
是前两天刚提取的dna，不能降解吧

建议上图。
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6楼2012-05-10 16:55:03
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左木堂堂主

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-11 17:35:47
liuxing1-1: 金币+1 2012-05-12 09:24:06
你提取土壤DNA是用的什么方法提的呢？我以前提的时候经常出现P不出来的现象，很正常。很可能是土壤里面腐殖酸的干扰，你分别将土样稀释10倍 20倍 50倍看看，那样能够减少下干扰物质的影响。此外，没有做切胶回收直接P的吗，还是用的专业的土壤DNA提取试剂盒？
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7楼2012-05-11 15:06:39
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 左木堂堂主 at 2012-05-11 15:06:39:
你提取土壤DNA是用的什么方法提的呢？我以前提的时候经常出现P不出来的现象，很正常。很可能是土壤里面腐殖酸的干扰，你分别将土样稀释10倍 20倍 50倍看看，那样能够减少下干扰物质的影响。此外，没有做切胶回收直 ...

土壤试剂盒，omega的
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8楼2012-05-11 15:22:20
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yanhua_2006

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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liuxing1-1: 金币+2 2012-05-12 09:23:57
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流哦 2012-05-12 15:38:34
我以前也出现过类似的问题，后来干脆直接整成50微升的体系，这样就好了。因为有些PCR管子的质量不是很好，会使酶液挂壁，影响PCR结果，总是P不出条带，后来我最近用的管子比较好，15微升都能P出来。还有一种方法，就是在PCR体系中加入一点儿BSA(牛血清白蛋白)，好像对这种现象比较好用，不过我自己没有试过，建议，你可以试试。
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9楼2012-05-11 19:51:27
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uneei

金虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-12 15:38:51
引用回帖:
8楼: Originally posted by liuxing1-1 at 2012-05-11 15:22:20:
土壤试剂盒，omega的

建议用Fast DNA SPIN Kit for Soil试剂盒，貌似你OMEGA的稍贵一点吧。提取出来的条带明亮，后面的PCR很好做了。
你的情况，我用酚氯仿法提DNA的时候碰到过，我认为还是提取出的DNA粗液杂质污染太多了导致的。
你用的试剂盒提取，照理说应该是比较纯的呀，会不会用力太粗暴导致条带断裂严重，影响扩增效果。
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10楼2012-05-12 11:13:36
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