应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 崩溃ing---PCR后无条带问题
51/1返回列表
查看: 2133  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)

[求助] 崩溃ing---PCR后无条带问题

本人打算做T-RFLP，现在正在做土壤总细菌16S PCR，引物是27F和1492R，PCR体系（25ul）是：dNTP（10UM） 0.5ul, 引物（10UM）各1uL，Taq E 0.5ul，10×buffer缓冲液（5U/uL），模板0.5uL，以水补齐。PCR条件是94℃预变性5 min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5 min，35个循环，72℃下延伸10min。按照这个条件，无法P出条带。期间，也换过EB染色液、TAE，但问题依旧。大家帮忙分析一下是什么原因吧。
还有，用先前提取的大田土壤DNA可以P出来，但是用我前两天刚刚提取的室内土样DNA竟然无法P出。下面个给出两种DNA的具体参数：
土样   浓度     260       280      260/280     260/230  PCR情况
大田    65.4     1.307     0.757     1.73           0.89         可以P出
室内    59.6     1.192     0.680     1.75           0.25         无法P出
室内    60.9      1.218    0.711    1.71             1.16         无法P出
请大家帮忙看看，这是怎么回事啊 ？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-05-10 08:34:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yanhua_2006

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuxing1-1: 金币+2 2012-05-12 09:23:57
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流哦 2012-05-12 15:38:34
我以前也出现过类似的问题，后来干脆直接整成50微升的体系，这样就好了。因为有些PCR管子的质量不是很好，会使酶液挂壁，影响PCR结果，总是P不出条带，后来我最近用的管子比较好，15微升都能P出来。还有一种方法，就是在PCR体系中加入一点儿BSA(牛血清白蛋白)，好像对这种现象比较好用，不过我自己没有试过，建议，你可以试试。
赞一下 回复此楼
9楼2012-05-11 19:51:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答

cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-10 13:51:30
liuxing1-1: 金币+1 2012-05-10 16:30:27
呵呵，个人浅见啊，我觉得是材料的问题，你要的是16s核糖体RNA，这个家伙是翻译蛋白用的，你室内的的土样肯定比大田活性低的多，你检测时的结果大概是混有DNA，反正不能保证完全是RNA，你可以参考一下，实验顺利啊
赞一下 回复此楼
我努力我奋斗我成功
2楼2012-05-10 11:36:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-05-10 11:36:18:
呵呵，个人浅见啊，我觉得是材料的问题，你要的是16s核糖体RNA，这个家伙是翻译蛋白用的，你室内的的土样肯定比大田活性低的多，你检测时的结果大概是混有DNA，反正不能保证完全是RNA，你可以参考一下，实验顺利啊

我提取的是土壤DNA啊，不是RNA
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-10 11:47:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

holyala

木虫 (著名写手)

砖家

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuxing1-1: 金币+2 2012-05-10 16:30:21
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-11 17:35:35
引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-05-10 11:36:18:
呵呵，个人浅见啊，我觉得是材料的问题，你要的是16s核糖体RNA，这个家伙是翻译蛋白用的，你室内的的土样肯定比大田活性低的多，你检测时的结果大概是混有DNA，反正不能保证完全是RNA，你可以参考一下，实验顺利啊

做16S一样可以从DNA开始的，不一定要提RNA再RT-PCR。16S rDNA这也不是什么新鲜概念了。

问LZ一个问题，你提完DNA就只测一个紫外就完了么？没有跑胶检测一下？DNA降解是可能的原因之一。另外，建议你做PCR的时候设置两个对照，阳性对照（确定能P出来的样本做模板）和阴性对照（无模板，补水），这样有利于分析结果，排除误差。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2012-05-10 15:07:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 26考研求调剂 +6 丶宏Sir 2026-03-13 6/300 2026-03-17 16:13 by 醉在风里
[考研] 材料专硕306英一数二 +6 z1z2z3879 2026-03-16 8/400 2026-03-17 14:03 by 勇敢太监王公公
[考研] 268求调剂 +7 一定有学上- 2026-03-14 8/400 2026-03-17 13:10 by zz820
[考研] 材料工程专硕274一志愿211求调剂 +6 薛云鹏 2026-03-15 6/300 2026-03-17 11:05 by 学员h26Tkc
[考研] 293求调剂 +5 世界首富 2026-03-11 5/250 2026-03-17 10:16 by Sammy2
[考研] 301求调剂 +3 A_JiXing 2026-03-16 3/150 2026-03-17 08:21 by 无际的草原
[考研] 一志愿，福州大学材料专硕339分求调剂 +3 木子momo青争 2026-03-15 3/150 2026-03-17 07:52 by laoshidan
[考研] [导师推荐]西南科技大学国防/材料导师推荐 +3 尖角小荷 2026-03-16 6/300 2026-03-16 23:21 by 尖角小荷
[考研] 0703化学调剂，求各位老师收留 +8 秋有木北 2026-03-14 8/400 2026-03-16 15:21 by 哦哦123
[考研] 070303 总分349求调剂 +3 LJY9966 2026-03-15 5/250 2026-03-16 14:24 by xwxstudy
[考研] 308求调剂 +3 是Lupa啊 2026-03-16 3/150 2026-03-16 10:07 by 求调剂zz
[考博] 东华理工大学化材专业26届硕士博士申请 +6 zlingli 2026-03-13 6/300 2026-03-15 20:00 by ryzcf
[考研] 中科大材料专硕319求调剂 +3 孟鑫材料 2026-03-13 3/150 2026-03-14 18:10 by houyaoxu
[考研] 学硕285求调剂 +13 Wisjxn 2026-03-12 46/2300 2026-03-14 10:33 by JourneyLucky
[基金申请] 有必要更换申报口吗 20+3 fannyamoy 2026-03-11 3/150 2026-03-14 00:52 by zhanghaozhu
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +6 邱gl 2026-03-12 7/350 2026-03-13 23:24 by 邱gl
[考研] 281求调剂 +9 Koxui 2026-03-12 11/550 2026-03-13 20:50 by Koxui
[考研] 求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-12 5/250 2026-03-13 18:31 by ms629
[考研] 工科材料085601 279求调剂 +8 困于星晨 2026-03-12 10/500 2026-03-13 15:42 by ms629
[考研] 求调剂 资源与环境 285 +3 未名考生 2026-03-10 3/150 2026-03-13 10:31 by houyaoxu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭