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求助~~~~~PCR产物条带分析
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我做的是PCR温度梯度，反向引物设计了两个，图片上六个条带两个两个是一组，总共三组，但是疑惑的是第四个条带怎么突然很亮，而且还不知道哪个温度比较适合 79 条件 3.27.jpg |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-04-02 20:55:51
gyesang: 回帖置顶 2013-05-02 12:09:53
c_yl: 金币+9, ★有帮助 2013-06-15 14:01:53
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| 额网上找的楼主将就看看 降落PCR（即touchdown PCR）是一种增加PCR反应特异性的优化方法。一般情况下，解决PCR非特异性扩增的方法是通过调整Mg++浓度或改变退火温度等来实现的，但这些方法既烦琐又耗时，Touchdown PCR利用一种简单的手段克服了这些复杂的问题。其基本原理是：设计多循环反应程序以使相连循环的退火温度越来越底。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平。这个策略有利于确保第一个引物摸板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些生产目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异性杂交的Tm值，但此时目的扩增物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异）PCR产物的地位。由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在Touchdown PCR中，必须应用热启动技术（hotstart）。编设Touchdown PCR程序的目的是要涉及一系列退火温度越来越低的循环，退火温度的范围应该跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃左右。例如：如果一对引物的计算Tm值为63℃，可设定PCR仪的退火温度从66℃降到50℃（每两个循环降低退火温度1℃），再在50℃退火温度下做15个循环。如果在Touchdown PCR中，持续出现假象带表明起始退火温度太低，或者目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，和（或）非目的扩增物以更高的效率扩增。把退火温度每降低1℃时所需要的循环数增加到3或4，有可能在非目的产物开始扩增以前给目的产物增加竞争优势。这时，应从程序的末尾去掉相应的循环数，以避免过度循环扩增产物的降解和产生高分子量成片产物。 |
9楼2013-03-31 10:30:24