| 查看: 4753 | 回复: 10 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
【求助/交流】做培养细胞的RT-PCR，β-actin内参出现两个条带，求原因。
|
|||
|
我进行培养细胞的RT-PCR，按试剂盒说明提取总RNA后，用一步法进行RT-PCR，用内参β-actin的引物进行，产物长度315bp，反应条件为：50摄氏度30min,94摄氏度2min，94摄氏度30s，59摄氏度30s,72摄氏度1min(上述三步进行30次），72摄氏度7分钟，然后用产物进行电泳，结果两个样本（是两瓶细胞中分别提取的总RNA)在紫外仪下均看到两个条带（见照片）。请问这是不是正常？ 另外我还有个问题请教：做RT-PCR是不是只要像这样条带出来就行了？如果要定量，是不是一个培养瓶里的细胞提出来的RNA只能算一个样本？比如我有两瓶细胞，一个做实验组加药，一个做对照组不加，两瓶细胞分别提取一份总RNA，然后各分成3份同时进行RT-PCR，最后获得6个电泳后的光度值（实验组3个，对照组3个），之后按实验组3个样本，对照组3个样本进行统计学分析。这样是不是可以？还是一定要实验组养3瓶细胞，对照组养3瓶细胞，每瓶提取1份总RNA？ 我第一次做RT-PCR，不太懂，谢谢帮助！   /*-------------------------------------以下为2月18日新增的---------------------*/ 又做了一次，从提总RNA开始，这次是正式实验，加了干预因素的，还分了时间段（上次只是走一遍整个过程）还是内参有两个条带，这次我是连目的基因一块儿做了，目的基因很好，但是内参还是有两个条带。这次我一共做了18个泳道，截图是其中4个，最左边是Marker，不太清楚，接着两条是目的基因，最右边是β-actin内参，还是有两个条带。我的问题是如果是DNA污染，应该是3个基因都有污染吧？我还有个问题：像这样的图片能定量吗？因为所有时间段的所有基因都有条带，也就是说没有空的，我问了实验室老师，实验室只能出这样的图片，出不了数据的。谢谢了。  [ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:50 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有196人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- western blot 内参β-actin图片异常
已经有11人回复
- RT-PCR、western blot检测所需细胞数及细胞培养板的选择
已经有7人回复
- 求助~~~~~PCR产物条带分析
已经有15人回复
- RT—PCR引物、条带问题，新手求助，求意见，求建议！
已经有9人回复
- 如何做 Western blot 以及RT-PCR 的加药处理时间梯度？细胞数量如何统一？
已经有9人回复
- RT-PCR结果分析求助
已经有5人回复
- realtime PCR 内参问题
已经有3人回复
- DNA的Marker总跑不开是什么原因？
已经有17人回复
- 最近RT-PCR能够出来内参，却没有目的条带，请各位高手帮忙
已经有9人回复
- ACTB 内参P不出来
已经有6人回复
- RT-PCR跑出来的条带没有量效关系怎么办？什么原因
已经有3人回复
- overlap PCR做不出来呐。。。。
已经有23人回复
- ＲＴ－ＰＣＲ问题求助
已经有18人回复
- 【求助/交流】RT-PCR ，内参在哪个步骤添加以及marker何时使用及确定？谢谢
已经有14人回复
- 【求助/交流】目的基因PCR后电泳出现多条带
已经有7人回复
- 【讨论】细胞培养时出现浑浊
已经有7人回复
- 【求助/交流】qRT-PCR需要做不加RT的对照吗？
已经有3人回复
- 【求助/交流】PCR条带不清楚
已经有11人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
物理学 调剂
+1/85
-
有没有在香港的虫友啊
+1/84
-
太原理工大学博士招生 电池负极材料 固态电解质方向 有工作经验者优先
+1/79
-
上海交通大学沈道智副教授招收2026年联培博士/硕士研究生（微纳器件与制造方向）
+1/37
-
澳大利亚西澳大学（UWA）张金强课题组招收全奖博士生（化工新能源方向）
+1/27
-
欢迎交流咨询
+1/18
-
国家级领军人才团队高分子材料方向2026年博士研究生招生
+1/16
-
南开大学罗景山教授课题组招收2026年入学博士生（光/电催化方向）
+2/14
-
南京林业大学化学工程学院柏惺峰课题组招收2026年申请考核制博士2名
+1/11
-
Top-88悉尼科技大学数据科学/AI 招收2027年入学 校奖 博士生1到2名(国际和本地学生）
+1/10
-
“机械、材料”招生
+1/9
-
哈尔滨理工大学材料与化学工程学院 纳米功能材料与光电催化团队 招收硕士研究生
+1/7
-
博士后招聘（高薪40万+）
+1/7
-
分离分析杰青课题组诚招科研人员
+1/7
-
【第三轮招生，31号截止】澳科大诚招2026秋全奖博士研究生（纳米医学/生物材料方向）
+1/6
-
26年申博自荐-计算机视觉
+1/5
-
双一流天津工业大学电信学院李鸿强教授招收2026年申请审核制博士3名
+1/5
-
首次招收资格，招收工科调剂！
+1/3
-
北京工业大学材料工程调剂03
+1/1
-
西北师范大学化学化工学院李健教授课题组接受化学、化工、材料类研究生调剂！
+1/1
zwdnet(金币+1): 对我帮助很大，非常感谢！ 2011-02-22 12:21:56
|
楼主的引物多长？如果在20边上徘徊的话估计是引物太短，特异性不够，可以考虑设计到25左右，而且可以把引物放到NCBI的引物BLAST里去BLAST一下，看是不是可以PCR出其他产物。另外可以增加退火温度，提高特异性。 如果楼主要进行统计学分析，个人认为必须3份分开提RNA，不能一起提了再分开做，不然就相当于是只有一个样本，重复3次而已。楼主要的是3个平行样本。 另外，提醒下楼主，内参的作用是用于消除模板量的差异，但是PCR的循环数和模板达到一定量时，产物的总量会达到一个平台，也就是说，模板加多加少，产物跑胶都会差不多的亮，这样楼主就会认为各体系内加入的模板数量是一样的（其实不可能一样），于是内参来消除模板量差异就无法起作用，要减少循环数，以达到内参之间的亮度有差异。 |
8楼2011-02-19 09:36:19
2楼2011-01-28 16:28:38
3楼2011-01-28 23:48:29
4楼2011-01-30 09:58:54
