24小时热门版块排行榜

>论坛更新日志 (4596)
>基金申请 (542)
>文献求助 (335)
>虫友互识 (326)
>休闲灌水 (244)
>导师招生 (227)
>硕博家园 (204)
>论文投稿 (144)
>考研 (116)
>考博 (107)
>公派出国 (83)
>论文道贺祈福 (79)
>教师之家 (75)
>招聘信息布告栏 (70)
>博后之家 (69)
>SciFinder/Reaxys (38)

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zwdnet

铁虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 182.7
帖子: 43
在线: 13.7小时
虫号: 613793

[交流] 【求助/交流】做培养细胞的RT-PCR，β-actin内参出现两个条带，求原因。

我进行培养细胞的RT-PCR，按试剂盒说明提取总RNA后，用一步法进行RT-PCR，用内参β-actin的引物进行，产物长度315bp，反应条件为：50摄氏度30min,94摄氏度2min，94摄氏度30s，59摄氏度30s,72摄氏度1min(上述三步进行30次），72摄氏度7分钟，然后用产物进行电泳，结果两个样本（是两瓶细胞中分别提取的总RNA)在紫外仪下均看到两个条带（见照片）。请问这是不是正常？
另外我还有个问题请教：做RT-PCR是不是只要像这样条带出来就行了？如果要定量，是不是一个培养瓶里的细胞提出来的RNA只能算一个样本？比如我有两瓶细胞，一个做实验组加药，一个做对照组不加，两瓶细胞分别提取一份总RNA，然后各分成3份同时进行RT-PCR，最后获得6个电泳后的光度值（实验组3个，对照组3个），之后按实验组3个样本，对照组3个样本进行统计学分析。这样是不是可以？还是一定要实验组养3瓶细胞，对照组养3瓶细胞，每瓶提取1份总RNA？
我第一次做RT-PCR，不太懂，谢谢帮助！

/*-------------------------------------以下为2月18日新增的---------------------*/
又做了一次，从提总RNA开始，这次是正式实验，加了干预因素的，还分了时间段（上次只是走一遍整个过程）还是内参有两个条带，这次我是连目的基因一块儿做了，目的基因很好，但是内参还是有两个条带。这次我一共做了18个泳道，截图是其中4个，最左边是Marker，不太清楚，接着两条是目的基因，最右边是β-actin内参，还是有两个条带。我的问题是如果是DNA污染，应该是3个基因都有污染吧？我还有个问题：像这样的图片能定量吗？因为所有时间段的所有基因都有条带，也就是说没有空的，我问了实验室老师，实验室只能出这样的图片，出不了数据的。谢谢了。

[ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:50 ]

回复此楼

» 猜你喜欢

含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松已经有0人回复
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析已经有0人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有257人回复
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析已经有0人回复
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析已经有0人回复
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析已经有0人回复
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析已经有0人回复
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析已经有0人回复
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点已经有0人回复
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂已经有0人回复

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

western blot 内参β-actin图片异常已经有11人回复
RT-PCR、western blot检测所需细胞数及细胞培养板的选择已经有7人回复
求助~~~~~PCR产物条带分析已经有15人回复
RT—PCR引物、条带问题，新手求助，求意见，求建议！已经有9人回复
如何做 Western blot 以及RT-PCR 的加药处理时间梯度？细胞数量如何统一？已经有9人回复
RT-PCR结果分析求助已经有5人回复
realtime PCR 内参问题已经有3人回复
DNA的Marker总跑不开是什么原因？已经有17人回复
最近RT-PCR能够出来内参，却没有目的条带，请各位高手帮忙已经有9人回复
ACTB 内参P不出来已经有6人回复
RT-PCR跑出来的条带没有量效关系怎么办？什么原因已经有3人回复
overlap PCR做不出来呐。。。。已经有23人回复
ＲＴ－ＰＣＲ问题求助已经有18人回复
【求助/交流】RT-PCR ，内参在哪个步骤添加以及marker何时使用及确定？谢谢已经有14人回复
【求助/交流】目的基因PCR后电泳出现多条带已经有7人回复
【讨论】细胞培养时出现浑浊已经有7人回复
【求助/交流】qRT-PCR需要做不加RT的对照吗？已经有3人回复
【求助/交流】PCR条带不清楚已经有11人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴

1楼 2011-01-28 09:43:36

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)

MolEPI: 2
应助: 1 (幼儿园)
金币: 1091.5
帖子: 210
在线: 107.9小时
虫号: 1097468

zwdnet(金币+1): 对我帮助很大，非常感谢！ 2011-02-22 12:21:56

楼主的引物多长？如果在20边上徘徊的话估计是引物太短，特异性不够，可以考虑设计到25左右，而且可以把引物放到NCBI的引物BLAST里去BLAST一下，看是不是可以PCR出其他产物。另外可以增加退火温度，提高特异性。
如果楼主要进行统计学分析，个人认为必须3份分开提RNA，不能一起提了再分开做，不然就相当于是只有一个样本，重复3次而已。楼主要的是3个平行样本。
另外，提醒下楼主，内参的作用是用于消除模板量的差异，但是PCR的循环数和模板达到一定量时，产物的总量会达到一个平台，也就是说，模板加多加少，产物跑胶都会差不多的亮，这样楼主就会认为各体系内加入的模板数量是一样的（其实不可能一样），于是内参来消除模板量差异就无法起作用，要减少循环数，以达到内参之间的亮度有差异。