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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何做 Western blot 以及RT-PCR 的加药处理时间梯度？细胞数量如何统一？
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porphybaby

金虫 (正式写手)

[求助] 如何做 Western blot 以及RT-PCR 的加药处理时间梯度？细胞数量如何统一？

最近一直纠结一个问题。

我用Hela细胞如何做Western blot的时间梯度？
现在我一直都是铺培养皿之后细胞贴壁后加药处理72h。然后裂细胞提蛋白，做的是加药浓度梯度。

一直想做时间梯度。但不知怎么做。
本身是想同时铺培养皿，然后加药后6h，24h，48h，72h分别拿去裂解提蛋白。再一起做WB。但又想到一个问题——关于“平摊到每个细胞上的药物量”的问题。

之前做浓度梯度，加药的时候细胞数量是一样的。72h之后它们大致也会长到80%~90%。 不过我之前铺的都很稀。

那如果是这样，岂不是我6h、24h 那些 细胞那么少，怎么跟48h 72h的比呢？

我怎么才能控制到24h，48h，72h时间点我收细胞的时候，细胞数量大体一样？

还是说，这个其实不影响结果?
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1楼 2012-12-18 22:44:57
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porphybaby

金虫 (正式写手)
顶起来~~~~比较急！！
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2楼2012-12-19 22:28:09
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porphybaby

金虫 (正式写手)
没有人知道这个问题怎么解决么？？？？
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3楼2012-12-20 14:55:03
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是不影响结果的，你分细胞的时候就是一瓶细胞给平均分到小平皿里面的哈，然后加药后检测按小时收集细胞就好了呢。。。
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4楼2012-12-20 15:45:29
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porphybaby

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-12-20 15:45:29
应该是不影响结果的，你分细胞的时候就是一瓶细胞给平均分到小平皿里面的哈，然后加药后检测按小时收集细胞就好了呢。。。

但是也就是说，我一开始铺的细胞数要够多？

因为我一般每次只铺5×10的4次方个 或1×10的5次方个细胞到培养皿

如果贴壁之后加药 24小时的时间 它根本就数量太少了啊 没法长满~~

我检测的时候不是很难检测？

我24小时的 跟48小时的 还有72小时 收的细胞数量肯定是不一样的啊~~

如果说要24小时的细胞足量 那我起初铺的细胞就得多 我72小时的那个 绝对会被挤死的~~48小时的恐怕也不行~~
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5楼2012-12-20 18:25:12
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porphybaby

金虫 (正式写手)
再顶啊~~~再求助！！！！
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6楼2012-12-20 23:33:07
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mguo15

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个问题好，简单点，就是你要矫正细胞数。可以用蛋白含量来定细胞量，复杂点可以根据你的细胞中结构性酶的活性来定量。不知回答了你的问题没有？
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7楼2012-12-21 11:15:53
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by porphybaby at 2012-12-20 18:25:12
但是也就是说，我一开始铺的细胞数要够多？

因为我一般每次只铺5×10的4次方个 或1×10的5次方个细胞到培养皿

如果贴壁之后加药 24小时的时间 它根本就数量太少了啊 没法长满~~

我检测的时候不是很难检测 ...

我看到的很多文献，都是要求细胞长到70-80%的时候进行时候，这个时候细胞处于对数期，然后进行药物干预实验。对于什么时候开始加药，没有准确的时间，主要要看细胞的状态怎么样以及细胞是不是处于对数期。准确的时间是对于你给药而言。不过做Western，RT-PCR的时候，细胞数量要保证，要多。
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8楼2012-12-21 16:59:49
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淘佩塔

新虫 (小有名气)
不知道楼主的问题解决了没有，我也想做时间依赖的western，也再纠结这个问题，楼主最后是怎么做的啊，盼楼主能指点一二~
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9楼2014-05-19 09:49:22
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cyf0011

新虫 (初入文坛)
不影响结果，因为最后蛋白上样量保持一致就好了。
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10楼2018-07-18 09:36:20
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