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porphybaby

金虫 (正式写手)

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[求助] 如何做 Western blot 以及RT-PCR 的加药处理时间梯度？细胞数量如何统一？

最近一直纠结一个问题。

我用Hela细胞如何做Western blot的时间梯度？
现在我一直都是铺培养皿之后细胞贴壁后加药处理72h。然后裂细胞提蛋白，做的是加药浓度梯度。

一直想做时间梯度。但不知怎么做。
本身是想同时铺培养皿，然后加药后6h，24h，48h，72h分别拿去裂解提蛋白。再一起做WB。但又想到一个问题——关于“平摊到每个细胞上的药物量”的问题。

之前做浓度梯度，加药的时候细胞数量是一样的。72h之后它们大致也会长到80%~90%。不过我之前铺的都很稀。

那如果是这样，岂不是我6h、24h 那些细胞那么少，怎么跟48h 72h的比呢？

我怎么才能控制到24h，48h，72h时间点我收细胞的时候，细胞数量大体一样？

还是说，这个其实不影响结果?

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1楼2012-12-18 22:44:57

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czcpudai

铜虫 (正式写手)

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引用回帖:

5楼: Originally posted by porphybaby at 2012-12-20 18:25:12
但是也就是说，我一开始铺的细胞数要够多？

因为我一般每次只铺5×10的4次方个或1×10的5次方个细胞到培养皿

如果贴壁之后加药 24小时的时间它根本就数量太少了啊没法长满~~

我检测的时候不是很难检测 ...

我看到的很多文献，都是要求细胞长到70-80%的时候进行时候，这个时候细胞处于对数期，然后进行药物干预实验。对于什么时候开始加药，没有准确的时间，主要要看细胞的状态怎么样以及细胞是不是处于对数期。准确的时间是对于你给药而言。不过做Western，RT-PCR的时候，细胞数量要保证，要多。