| 查看: 4766 | 回复: 10 | |||
[交流]
【求助/交流】做培养细胞的RT-PCR，β-actin内参出现两个条带，求原因。
|
|
我进行培养细胞的RT-PCR，按试剂盒说明提取总RNA后，用一步法进行RT-PCR，用内参β-actin的引物进行，产物长度315bp，反应条件为：50摄氏度30min,94摄氏度2min，94摄氏度30s，59摄氏度30s,72摄氏度1min(上述三步进行30次），72摄氏度7分钟，然后用产物进行电泳，结果两个样本（是两瓶细胞中分别提取的总RNA)在紫外仪下均看到两个条带（见照片）。请问这是不是正常？ 另外我还有个问题请教：做RT-PCR是不是只要像这样条带出来就行了？如果要定量，是不是一个培养瓶里的细胞提出来的RNA只能算一个样本？比如我有两瓶细胞，一个做实验组加药，一个做对照组不加，两瓶细胞分别提取一份总RNA，然后各分成3份同时进行RT-PCR，最后获得6个电泳后的光度值（实验组3个，对照组3个），之后按实验组3个样本，对照组3个样本进行统计学分析。这样是不是可以？还是一定要实验组养3瓶细胞，对照组养3瓶细胞，每瓶提取1份总RNA？ 我第一次做RT-PCR，不太懂，谢谢帮助！   /*-------------------------------------以下为2月18日新增的---------------------*/ 又做了一次，从提总RNA开始，这次是正式实验，加了干预因素的，还分了时间段（上次只是走一遍整个过程）还是内参有两个条带，这次我是连目的基因一块儿做了，目的基因很好，但是内参还是有两个条带。这次我一共做了18个泳道，截图是其中4个，最左边是Marker，不太清楚，接着两条是目的基因，最右边是β-actin内参，还是有两个条带。我的问题是如果是DNA污染，应该是3个基因都有污染吧？我还有个问题：像这样的图片能定量吗？因为所有时间段的所有基因都有条带，也就是说没有空的，我问了实验室老师，实验室只能出这样的图片，出不了数据的。谢谢了。  [ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:50 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有122人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- western blot 内参β-actin图片异常
已经有11人回复
- RT-PCR、western blot检测所需细胞数及细胞培养板的选择
已经有7人回复
- 求助~~~~~PCR产物条带分析
已经有15人回复
- RT—PCR引物、条带问题，新手求助，求意见，求建议！
已经有9人回复
- 如何做 Western blot 以及RT-PCR 的加药处理时间梯度？细胞数量如何统一？
已经有9人回复
- RT-PCR结果分析求助
已经有5人回复
- realtime PCR 内参问题
已经有3人回复
- DNA的Marker总跑不开是什么原因？
已经有17人回复
- 最近RT-PCR能够出来内参，却没有目的条带，请各位高手帮忙
已经有9人回复
- ACTB 内参P不出来
已经有6人回复
- RT-PCR跑出来的条带没有量效关系怎么办？什么原因
已经有3人回复
- overlap PCR做不出来呐。。。。
已经有23人回复
- ＲＴ－ＰＣＲ问题求助
已经有18人回复
- 【求助/交流】RT-PCR ，内参在哪个步骤添加以及marker何时使用及确定？谢谢
已经有14人回复
- 【求助/交流】目的基因PCR后电泳出现多条带
已经有7人回复
- 【讨论】细胞培养时出现浑浊
已经有7人回复
- 【求助/交流】qRT-PCR需要做不加RT的对照吗？
已经有3人回复
- 【求助/交流】PCR条带不清楚
已经有11人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
电力全国重点实验室双一流A类长江学者团队招2026年全日制博士1名（4月3日截止）
+2/110
-
物理学 调剂
+1/85
-
太原理工大学博士招生 电池负极材料 固态电解质方向 有工作经验者优先
+1/79
-
光学工程学硕调剂信息
+2/50
-
2026年工科硕士调剂-上海大学全国重点实验室团队-材料数据挖掘方向-研究生3-5人
+1/30
-
中山大学院士团队微纳器件、脑机接口方向博士招生、博后招聘
+1/20
-
新加坡国立大学药学系化学生物学课题组招PhD
+1/14
-
新加坡国立大学药学系化学生物学课题组招PhD
+1/13
-
26年申博自荐-计算机视觉
+1/7
-
华中科技大学管理学院招聘社会用工（科研助理）1名
+1/6
-
国家杰青低维材料与器件力学团队2026年招收博士研究生
+1/5
-
重庆大学诚招2026年生物材料方向博士生
+1/4
-
南方科技大学生命科学学院基础免疫与微生物学系招收博士后
+1/4
-
Top-88悉尼科技大学数据科学/AI 招收2027年入学 校奖 博士生1到2名(国际和本地学生）
+1/4
-
深圳大学蔡兴科课题组博士后及研究助理招聘
+1/2
-
125603工业工程与管理调剂
+1/2
-
323分控制工程求调剂
+1/2
-
药学专硕一志愿苏大本科苏大寻求B区高校调剂名额
+1/1
-
招收理论凝聚态物理/纳米光学/量子计算方向博士、硕士研究生/博士后
+1/1
-
085404 270求调剂，b区求导师收留接受跨专业
+1/1
2楼2011-01-28 16:28:38
3楼2011-01-28 23:48:29
4楼2011-01-30 09:58:54
5楼2011-01-30 11:05:15
6楼2011-02-07 16:43:55
7楼2011-02-18 12:45:27
zwdnet(金币+1): 对我帮助很大，非常感谢！ 2011-02-22 12:21:56
|
楼主的引物多长？如果在20边上徘徊的话估计是引物太短，特异性不够，可以考虑设计到25左右，而且可以把引物放到NCBI的引物BLAST里去BLAST一下，看是不是可以PCR出其他产物。另外可以增加退火温度，提高特异性。 如果楼主要进行统计学分析，个人认为必须3份分开提RNA，不能一起提了再分开做，不然就相当于是只有一个样本，重复3次而已。楼主要的是3个平行样本。 另外，提醒下楼主，内参的作用是用于消除模板量的差异，但是PCR的循环数和模板达到一定量时，产物的总量会达到一个平台，也就是说，模板加多加少，产物跑胶都会差不多的亮，这样楼主就会认为各体系内加入的模板数量是一样的（其实不可能一样），于是内参来消除模板量差异就无法起作用，要减少循环数，以达到内参之间的亮度有差异。 |
8楼2011-02-19 09:36:19
9楼2011-02-19 10:06:53
10楼2011-02-19 16:07:21
11楼2011-02-19 17:21:38
