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zwdnet

铁虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】做培养细胞的RT-PCR，β-actin内参出现两个条带，求原因。

我进行培养细胞的RT-PCR，按试剂盒说明提取总RNA后，用一步法进行RT-PCR，用内参β-actin的引物进行，产物长度315bp，反应条件为：50摄氏度30min,94摄氏度2min，94摄氏度30s，59摄氏度30s,72摄氏度1min(上述三步进行30次），72摄氏度7分钟，然后用产物进行电泳，结果两个样本（是两瓶细胞中分别提取的总RNA)在紫外仪下均看到两个条带（见照片）。请问这是不是正常？
另外我还有个问题请教：做RT-PCR是不是只要像这样条带出来就行了？如果要定量，是不是一个培养瓶里的细胞提出来的RNA只能算一个样本？比如我有两瓶细胞，一个做实验组加药，一个做对照组不加，两瓶细胞分别提取一份总RNA，然后各分成3份同时进行RT-PCR，最后获得6个电泳后的光度值（实验组3个，对照组3个），之后按实验组3个样本，对照组3个样本进行统计学分析。这样是不是可以？还是一定要实验组养3瓶细胞，对照组养3瓶细胞，每瓶提取1份总RNA？
我第一次做RT-PCR，不太懂，谢谢帮助！

/*-------------------------------------以下为2月18日新增的---------------------*/
又做了一次，从提总RNA开始，这次是正式实验，加了干预因素的，还分了时间段（上次只是走一遍整个过程）还是内参有两个条带，这次我是连目的基因一块儿做了，目的基因很好，但是内参还是有两个条带。这次我一共做了18个泳道，截图是其中4个，最左边是Marker，不太清楚，接着两条是目的基因，最右边是β-actin内参，还是有两个条带。我的问题是如果是DNA污染，应该是3个基因都有污染吧？我还有个问题：像这样的图片能定量吗？因为所有时间段的所有基因都有条带，也就是说没有空的，我问了实验室老师，实验室只能出这样的图片，出不了数据的。谢谢了。

[ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:50 ]

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1楼 2011-01-28 09:43:36

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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)

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我说的BLAST是引物BLAST，你把两条引物放进去，BLAST后，可以给你分析出可能会PCR出哪些基因。恩，如果只是定性的话，内参基本不重要，内参是用于RT-PCR半定量时用的，我所说的循环数影响也只是在半定量时有用。
18 19的话PCR mRNA还是有点少，如果PCR质粒的话 15都没问题，但是mRNA中含的基因太多，18 19的话特异性有点低了建议23以上的话比较好，每多一个碱基理论上特异性提高四倍。