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zwdnet

铁虫 (初入文坛)


[交流] 【求助/交流】做培养细胞的RT-PCR,β-actin内参出现两个条带,求原因。

我进行培养细胞的RT-PCR,按试剂盒说明提取总RNA后,用一步法进行RT-PCR,用内参β-actin的引物进行,产物长度315bp,反应条件为:50摄氏度30min,94摄氏度2min,94摄氏度30s,59摄氏度30s,72摄氏度1min(上述三步进行30次),72摄氏度7分钟,然后用产物进行电泳,结果两个样本(是两瓶细胞中分别提取的总RNA)在紫外仪下均看到两个条带(见照片)。请问这是不是正常?
另外我还有个问题请教:做RT-PCR是不是只要像这样条带出来就行了?如果要定量,是不是一个培养瓶里的细胞提出来的RNA只能算一个样本?比如我有两瓶细胞,一个做实验组加药,一个做对照组不加,两瓶细胞分别提取一份总RNA,然后各分成3份同时进行RT-PCR,最后获得6个电泳后的光度值(实验组3个,对照组3个),之后按实验组3个样本,对照组3个样本进行统计学分析。这样是不是可以?还是一定要实验组养3瓶细胞,对照组养3瓶细胞,每瓶提取1份总RNA?
我第一次做RT-PCR,不太懂,谢谢帮助!


/*-------------------------------------以下为2月18日新增的---------------------*/
又做了一次,从提总RNA开始,这次是正式实验,加了干预因素的,还分了时间段(上次只是走一遍整个过程)还是内参有两个条带,这次我是连目的基因一块儿做了,目的基因很好,但是内参还是有两个条带。这次我一共做了18个泳道,截图是其中4个,最左边是Marker,不太清楚,接着两条是目的基因,最右边是β-actin内参,还是有两个条带。我的问题是如果是DNA污染,应该是3个基因都有污染吧?我还有个问题:像这样的图片能定量吗?因为所有时间段的所有基因都有条带,也就是说没有空的,我问了实验室老师,实验室只能出这样的图片,出不了数据的。谢谢了。


[ Last edited by zwdnet on 2011-2-18 at 22:50 ]
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铁虫 (初入文坛)


引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-01-28 16:28:38:
怎么没有marker啊?

这EB加的也太多了,胶都红了。。

marker是最左边那个,好像是100bp到400bp的,我是在电泳仪旁边的紫外仪里用自己的数码相机拍的,不是专门的拍电泳图片的设备(当时已经六点多,管拍照的老师下班了),那个紫外仪只是给人观察用的,前面有个小门,平时观察时要关门的,为了拍照只能半开着,偏红不知道是不是这个原因。谢谢。
3楼2011-01-28 23:48:29
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rioarsenal

金虫 (正式写手)



amisking(金币+1): 鼓励发帖交流! 2011-01-28 19:44:00
怎么没有marker啊?

这EB加的也太多了,胶都红了。。
2楼2011-01-28 16:28:38
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lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-02-18 19:57:45
不是引物特异性不好,就是提取的RNA有DNA污染

marker不清晰,没法怎么判断~~
4楼2011-01-30 09:58:54
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shaquila

金虫 (正式写手)


是不是有DNA污染~~
5楼2011-01-30 11:05:15
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