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jiangqingbin

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】目的基因PCR后电泳出现多条带

各位大虫,我用农杆菌提取的质粒DNA,然后对目的基因(450bp)进行PCR扩增,电泳后发现多条带,其中两条最为清晰,用的marker是100bp的,发现在1000bp附近也有一条很清晰地带,请问是什么原因?
我对引物重复核对了几次,并且找公司又重新合成,可还是出现这样的结果。
是不是在提DNA后RNA溶解不充分,扩增体系里DNA样本量太多跑出条带,
或者DNA模板量太少出现引物二聚体等等....
还请各位大牛帮忙指导!!多谢
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snowice

银虫 (小有名气)


jiangqingbin(金币+2): 2010-09-15 14:41:50
scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-09-15 23:30:00
不会是引物二聚体,它一般都在100bp以下,升高一下退火温度,看看行不行,拿你的引物和重组质粒的序列在NCBI上Blast一下,看看有没有其他结合的地方,最后再考虑模板的问题。不行就割胶回收嘛,如果你是要pcr产物的话
爱吃爱睡懒得要死的猪头
2楼2010-09-15 12:24:01
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zdmei

金虫 (小有名气)


jiangqingbin(金币+2): 2010-09-15 14:41:56
scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-09-15 23:30:07
可能是引物在该质粒上有错配吧,可以适当提高退火温度。其实有你的目的条带就行,建议再对质粒做个酶切鉴定,还可以送测序但可能不太好测出来。
3楼2010-09-15 12:32:49
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在雨中

金虫 (著名写手)



scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-09-15 23:30:12
jiangqingbin(金币+1): 2010-09-18 10:16:47
jiangqingbin(金币+2): 2010-10-07 12:17:13
适当提高退火温度.或者采用touchdown PCR,提高产物的特异性.
另外还要注意PCR操作时不要污染了样品.样品污染了也有可能产生非特异扩增
4楼2010-09-15 14:59:04
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heismeng

金虫 (小有名气)

jiangqingbin(金币+1): 2010-09-18 10:16:41
这个可能是引物的问题吧 TOUCHDOWN试试 或者重新设计引物 一般情况PLASMID做模板应该很好扩吧
5楼2010-09-15 15:03:42
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jiangqingbin

金虫 (正式写手)

scelab:图真漂亮 2010-09-15 23:30:56
引用回帖:
Originally posted by jiangqingbin at 2010-09-15 12:01:13:
各位大虫,我用农杆菌提取的质粒DNA,然后对目的基因VirD1(450bp)进行PCR扩增,电泳后发现多条带,其中两条最为清晰,用的marker是100bp的,发现在1000bp附近也有一条很清晰地带,请问是什么原因?
我对引物重复核对 ...

引物序列为:
引物1  5' ATGTCGCAAGGACGTAAGCCCA 3'
引物2  5' GGAGTCTTTCAGCATGGAGCAA 3'
6楼2010-09-15 16:13:46
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tj_fjl

新虫 (初入文坛)

jiangqingbin(金币+1): 2010-09-18 10:16:35
模板污染,或者特异性不好,用TOUCHDOWN试试!
7楼2010-09-16 09:19:30
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zdmei

金虫 (小有名气)

jiangqingbin(金币+1): 2010-09-18 10:16:31
看起来像是污染,有做过水对照吗?
8楼2010-09-16 14:14:31
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