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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 跑PCR，琼脂糖电泳没有条带出现
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美丽的家园

金虫 (正式写手)

[求助] 跑PCR，琼脂糖电泳没有条带出现

新手，还望大家指正!
真菌总DNA提取，琼脂糖（0.8％）电泳 检测，是有亮带的，PCR后检测，却无.
模板 DNA 1μL,10×PCR buffer(MgCl2 20 mmol/L) 2.50 μL，dNTPs(10 mmol/L 0.5μL，10 μmol/L的正向引物 0.5 μL，10 μmol/L反向引物0.5μL，5 U/ μL Taq DNA Polymerase 0.200 μL，加ddH2O 补足至25.00 μL。
PCR扩增条件:94℃预变性5 min，95℃变性50 s，53℃复性40 s，72℃延伸 50 s，30个循环，72℃延伸5 min。
跑PCR失败，为什么呢？
有时maker 条带很暗，不是染色剂（Gelred）剂量问题,怎么回事呢？
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1楼 2013-08-16 18:04:02
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mingcui1003 at 2013-08-16 21:32:06
PCR跑不出条带的原因有很多，反应体系中各反应物的浓度不合适，反应程序，引物，退火温度，模板的质量等等都会对结果有很大的影响，初次实验，建议做一下优化，即选择不同浓度的反应体系，不同的反应程序和退火温度 ...

引物、模板、酶、dNTP、Mg+等都是跑PCR的重要因素，在此基础上设计不同的浓度，退火温度没有做，我想如果有条带不清晰的话，改变一下退火温度试试，不同的反应体系变化还好，不同反应程序，退回温度，每次失败重跑很费时间，有没有比较好一些的设计方法呢
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3楼2013-08-17 10:00:07
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mingcui1003

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-08-16 22:00:06
美丽的家园: 金币+5 2013-08-17 10:00:21
PCR跑不出条带的原因有很多，反应体系中各反应物的浓度不合适，反应程序，引物，退火温度，模板的质量等等都会对结果有很大的影响，初次实验，建议做一下优化，即选择不同浓度的反应体系，不同的反应程序和退火温度都试一下，多试几次，如果模板质量没问题，选用引物合适的话，应该能做出来的！
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2楼2013-08-16 21:32:06
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mingcui1003

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 美丽的家园 at 2013-08-17 10:00:07
引物、模板、酶、dNTP、Mg+等都是跑PCR的重要因素，在此基础上设计不同的浓度，退火温度没有做，我想如果有条带不清晰的话，改变一下退火温度试试，不同的反应体系变化还好，不同反应程序，退回温度，每次失败重跑 ...

反应体系在合适的范围内稍微变化一下影响不大，反应程序影响是比较大的，有时文献上报道的程序你按那个做不一定做的出来，我的经验是多查几篇相关的文献，多试几个程序，总有能跑的出来的，退火温度一般的PCR仪都可以设置不同的退火温度梯度，这个试起来比较方便，还有你可以在反应体系中加适量的BSA，用来保护酶的活性，我也做过真菌，反应体系中加了BSA，基本能跑出来
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4楼2013-08-17 16:33:55
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周圆圆1989

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
美丽的家园: 金币+5 2013-08-17 17:42:37
会不会浓度太小，我跑过好几次，荧光能检测出来但是琼脂糖电泳显现不出来
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5楼2013-08-17 16:40:22
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