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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR扩增空白有条带
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qx4117

银虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增空白有条带

跟大家请教一个问题，在做在PCR扩增细菌16S的时候，空白总是有一条与目的基因一样大小的条带（预混液、引物都是新的），希望大家能帮忙分析一下！谢谢啦！
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1楼 2013-10-12 22:48:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-13 02:42:13
qx4117: 金币+1, ★有帮助 2013-10-14 01:02:33
PCR体系污染。检测各个组分，做各种空白对照。还有可能是水、枪头、空气的污染。
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2楼2013-10-13 01:22:46
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rongduoyan

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qx4117: 金币+1, ★有帮助 2013-10-14 01:09:09
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-17 01:07:42
污染无处不在啊，曾经我也遇到过。怎么做阴性对照都呈假阳性。
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3楼2013-10-13 07:20:25
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qx4117: 金币+1, ★有帮助 2013-10-14 01:08:55
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-14 08:26:35
你扩增的是细菌的16sRNA吗？那你最好在扩增之前仔细检查一下你的枪头、还有PCR管，如果这些没有灭干净的话PCR时很容易扩增处条带，在者，你可以看一下你的空白的条带的亮度是否与实验组目的条带亮度接近，如果比实验组暗说明是你污染的问题
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4楼2013-10-13 08:51:05
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qx4117

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-13 01:22:46
PCR体系污染。检测各个组分，做各种空白对照。还有可能是水、枪头、空气的污染。

可是要是发现有污染的话，该怎么消除污染？灭完菌后，菌杀死，不是还应该有DNA残留吗？不知道这么理解对不对？
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5楼2013-10-14 01:05:14
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qx4117

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by rongduoyan at 2013-10-13 07:20:25
污染无处不在啊，曾经我也遇到过。怎么做阴性对照都呈假阳性。

对啊，并且做出来的空白对照都和目的条带一样亮！那最后你是怎样解决的呢？
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6楼2013-10-14 01:06:11
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qx4117

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 20083630zhan at 2013-10-13 08:51:05
你扩增的是细菌的16sRNA吗？那你最好在扩增之前仔细检查一下你的枪头、还有PCR管，如果这些没有灭干净的话PCR时很容易扩增处条带，在者，你可以看一下你的空白的条带的亮度是否与实验组目的条带亮度接近，如果比实验 ...

扩增的是16S rDNA，扩增出来的空白的条带竟然和目的条带一样亮。
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7楼2013-10-14 01:08:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-15 10:47:53
引用回帖:
5楼: Originally posted by qx4117 at 2013-10-14 01:05:14
可是要是发现有污染的话，该怎么消除污染？灭完菌后，菌杀死，不是还应该有DNA残留吗？不知道这么理解对不对？...

你找出污染的原因了？耗材灭菌是为了消除核酸酶的活性，并且保障使用时不污染试剂。如果是哪个试剂污染了，需要重新配置。
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8楼2013-10-14 15:20:25
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qx4117

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-14 15:20:25
你找出污染的原因了？耗材灭菌是为了消除核酸酶的活性，并且保障使用时不污染试剂。如果是哪个试剂污染了，需要重新配置。...

还没有，枪头和水都重新灭菌了，而且试剂也重新换了。还是有啊！而且空白的条带还很亮。
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9楼2013-10-16 00:49:43
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mangmanglulu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
qx4117: 金币+1, ★有帮助 2013-10-16 22:57:43
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-17 01:07:51
应该是空气污染，前段时间实验室做植物的阴性对照都有，动物的没事，初步怀疑空气污染，据相关人士说，停做实验三个月以上就没事了，我们那时候用什么次氯酸什么的喷雾了一下，后来好多了，记得多通风！！！
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10楼2013-10-16 08:24:33
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