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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 半定量RT-PCR电泳条带越来越浅
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花种太阳葵

铁虫 (初入文坛)

[求助] 半定量RT-PCR电泳条带越来越浅

最近被半定量弄得很头疼，希望有高手可以支支招。样本是从小鼠的各个组织中提取的。目前还在摸索管家基因的条件，目的基因头几次都没带就暂时没做了。
         具体情况如下：图A是最开始跑的，条带很亮，就是电压过高，条带有点弯曲；图B是图A后一次做的，有两个组织亮度明显较暗，所以也不能用：由于老板怀疑cDNA已经降解，导致条带较暗，所以图C是重新稀释模板做的，但是条带就不如以前亮了；图D是用的另外一批样品做的，浓度最开始有点不一致；图E是调整稀释倍数后做的，亮度差不多了，但是却比之前淡了很多。
         电泳缓冲液，dNTP，引物和模板都是新鲜的，条带反而越来越淡，所以我怀疑是制胶的问题。我们用的是EB，老板让胶煮开后就直接加EB，说是 不会有影响。可是EB不是65度以上会挥发吗？现在老板又说不是引物有问题就是我的操作有问题。可是我的操作和之前没有任何变化啊，引物也没有变啊~冤死了
         请大家出点主意~

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1楼 2013-03-11 13:28:34
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lhs521521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看似是模板降解了，可以加大模板量，如果不麻烦可以重新提一下RNA！
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寻找真正的自我！
2楼2013-03-11 14:40:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉你的胶也有问题，marker后来也不如开始的亮。
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3楼2013-03-12 02:17:29
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花种太阳葵

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-03-11 14:40:31
看似是模板降解了，可以加大模板量，如果不麻烦可以重新提一下RNA！

是呀，我也觉得胶有问题，可是想不出来是哪里有问题啊。电泳液是新换的，胶也是新的啊，而且制法也没有改变啊。就是一直都是按老板要求，胶煮开之后就马上加EB，这个是原因吗？
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4楼2013-03-12 15:40:37
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花种太阳葵

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-03-11 14:40:31
看似是模板降解了，可以加大模板量，如果不麻烦可以重新提一下RNA！

可是我后面越来越淡恰好是换了一批模板啊，之前转成cDNA之后就一直放在-40度呀，这样也会降解吗？
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5楼2013-03-12 15:44:10
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lhs521521

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 花种太阳葵 at 2013-03-12 15:44:10
可是我后面越来越淡恰好是换了一批模板啊，之前转成cDNA之后就一直放在-40度呀，这样也会降解吗？...

放的时间长了肯定是不好的，我的意思是PCR时多加点模板，循环数也加大，这样会亮一些！
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寻找真正的自我！
6楼2013-03-12 19:28:03
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