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花种太阳葵

铁虫 (初入文坛)

[求助] 半定量RT-PCR电泳条带越来越浅

最近被半定量弄得很头疼,希望有高手可以支支招。样本是从小鼠的各个组织中提取的。目前还在摸索管家基因的条件,目的基因头几次都没带就暂时没做了。
         具体情况如下:图A是最开始跑的,条带很亮,就是电压过高,条带有点弯曲;图B是图A后一次做的,有两个组织亮度明显较暗,所以也不能用:由于老板怀疑cDNA已经降解,导致条带较暗,所以图C是重新稀释模板做的,但是条带就不如以前亮了;图D是用的另外一批样品做的,浓度最开始有点不一致;图E是调整稀释倍数后做的,亮度差不多了,但是却比之前淡了很多。
         电泳缓冲液,dNTP,引物和模板都是新鲜的,条带反而越来越淡,所以我怀疑是制胶的问题。我们用的是EB,老板让胶煮开后就直接加EB,说是 不会有影响。可是EB不是65度以上会挥发吗?现在老板又说不是引物有问题就是我的操作有问题。可是我的操作和之前没有任何变化啊,引物也没有变啊~冤死了
         请大家出点主意~

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lhs521521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
看似是模板降解了,可以加大模板量,如果不麻烦可以重新提一下RNA!
寻找真正的自我!
2楼2013-03-11 14:40:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
感觉你的胶也有问题,marker后来也不如开始的亮。
3楼2013-03-12 02:17:29
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花种太阳葵

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-03-11 14:40:31
看似是模板降解了,可以加大模板量,如果不麻烦可以重新提一下RNA!

是呀,我也觉得胶有问题,可是想不出来是哪里有问题啊。电泳液是新换的,胶也是新的啊,而且制法也没有改变啊。就是一直都是按老板要求,胶煮开之后就马上加EB,这个是原因吗?
4楼2013-03-12 15:40:37
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花种太阳葵

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-03-11 14:40:31
看似是模板降解了,可以加大模板量,如果不麻烦可以重新提一下RNA!

可是我后面越来越淡恰好是换了一批模板啊,之前转成cDNA之后就一直放在-40度呀,这样也会降解吗?
5楼2013-03-12 15:44:10
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lhs521521

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 花种太阳葵 at 2013-03-12 15:44:10
可是我后面越来越淡恰好是换了一批模板啊,之前转成cDNA之后就一直放在-40度呀,这样也会降解吗?...

放的时间长了肯定是不好的,我的意思是PCR时多加点模板,循环数也加大,这样会亮一些!
寻找真正的自我!
6楼2013-03-12 19:28:03
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