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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 农林 » 植保 » 求助:PCR扩增出现问题，求指点
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邂逅星期八

金虫 (正式写手)

[求助] 求助:PCR扩增出现问题，求指点

自己设计的引物，在做温度梯度时条带比较亮，但按照这个条件做扩增却扩增不出来（温度、循环都一致），其中一对引物只在用做温度梯度的模板下出条带，换模板就不出（换的模板是一个种群的不同个体的DNA），有哪些可能的原因啊，求高人指点
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青春就要在路上
1楼 2013-06-06 15:40:08
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甜甜520smile

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
邂逅星期八: 金币+5, ★★★很有帮助, 非常感谢，为我修正实验提供了思路 2013-06-06 17:30:19
是不是你换了PCR仪器？
换换TAq酶？建议用混合的mix
不知道是不是你加样的时候在冰上没有？
还有模板处理的浓度？
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2楼2013-06-06 16:28:26
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邂逅星期八

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 甜甜520smile at 2013-06-06 16:28:26
是不是你换了PCR仪器？
换换TAq酶？建议用混合的mix
不知道是不是你加样的时候在冰上没有？
还有模板处理的浓度？

PCR仪是换了，但是温度设置都精确到小数点后了，PCR仪影响很大吗？模板浓度是提高了...需不需要重新做梯度？
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青春就要在路上
3楼2013-06-06 17:27:38
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甜甜520smile

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 邂逅星期八 at 2013-06-06 17:27:38
PCR仪是换了，但是温度设置都精确到小数点后了，PCR仪影响很大吗？模板浓度是提高了...需不需要重新做梯度？...

有些PCR仪器不是很稳定，建议你做梯度或者后继试验的时候，尽量将PCR管放在仪器的中间部分，同时仪器的四个角落可以放装满水的PCR管，这样可以使仪器温度相对稳定些。
同时加样的时候，尽量在冰上操作，引物和酶避免反复冻融
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4楼2013-06-07 11:20:22
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realismsy

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 邂逅星期八 at 2013-06-06 17:27:38
PCR仪是换了，但是温度设置都精确到小数点后了，PCR仪影响很大吗？模板浓度是提高了...需不需要重新做梯度？...

PCR仪很看缘分的，如果一开始哪一台好使就盯着一台用
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5楼2013-06-09 18:33:12
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邂逅星期八

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by realismsy at 2013-06-09 18:33:12
PCR仪很看缘分的，如果一开始哪一台好使就盯着一台用...

近十个人共用一台，我也想以后就用一台
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青春就要在路上
6楼2013-06-09 20:01:09
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