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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌落PCR有目的条带，重组质粒提取PCR却没条带，请问是什么原因？
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR有目的条带，重组质粒提取PCR却没条带，请问是什么原因？已有3人参与

菌落PCR有目的条带，重组质粒PCR却没条带，然后提取质粒跑电泳，也没观察到重组之后大小的目的条带，有很多杂带，请问可能是什么原因啊？
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1楼2014-03-20 15:54:30
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回帖置顶 ( 共有1个 )

tu475575025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
笑笑打dota(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 20:01:16
gyesang: 回帖置顶 2014-03-31 20:01:18
直接在平板上挑菌落是可能沾到平板上你转化时用的DNA，所以你p出来可能全是阳性。你一定要用菌体做pcr建议先挑出来在1.5ml ep管里少量（500ul左右）培养一点，再用菌体做pcr，或者直接做菌液pcr。另外，如果你的插入片段够大（1k以上）的话，你可以直接跑菌液电泳，以空质粒（不要用线性的哟）作对比，如果是阳性转化子，质粒会滞后（重组质粒比空质粒大）。
菌液电泳：裂解液为2%SDS和0.4M NaoH1：1混合
裂解液10ul+菌液20ul 裂解2-5min后加入2ul溴酚蓝，全部点孔（制大孔的胶，不要放在缓冲液中点），观察质粒滞后的转化子一般就是你的阳性。
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笑笑打dota
8楼2014-03-23 21:13:23
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

1057910381

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-03-21 08:55:56
使用菌液PCR吧，你转化时的DNA可能占到长得菌落上了，所以PCR时可能会有条带
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2楼2014-03-20 18:20:54
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-03-21 08:56:00
菌落PCR时有污染，重新筛一下，多选几个阳性菌提质粒验证。
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hehe
3楼2014-03-20 19:34:01
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 1057910381 at 2014-03-20 18:20:54
使用菌液PCR吧，你转化时的DNA可能占到长得菌落上了，所以PCR时可能会有条带

哦，谢谢啦，再去试试。
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4楼2014-03-21 09:11:44
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-20 19:34:01
菌落PCR时有污染，重新筛一下，多选几个阳性菌提质粒验证。

说道污染想起来了，可能是质粒转化感受态的时候无菌操作没做好。再重来一遍试试。谢谢。
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5楼2014-03-21 09:13:58
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1057910381

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 笑笑打dota at 2014-03-21 09:11:44
哦，谢谢啦，再去试试。...

不客气啊
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6楼2014-03-21 12:45:15
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 1057910381 at 2014-03-21 12:45:15
不客气啊...

7楼2014-03-23 18:50:36
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by tu475575025 at 2014-03-23 21:13:23
直接在平板上挑菌落是可能沾到平板上你转化时用的DNA，所以你p出来可能全是阳性。你一定要用菌体做pcr建议先挑出来在1.5ml ep管里少量（500ul左右）培养一点，再用菌体做pcr，或者直接做菌液pcr。另外，如果你的插入 ...

哈哈哈，好详细，非常感谢！！！
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9楼2014-03-24 10:15:47
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beatrice1018

新虫 (初入文坛)
楼主，我最近也出现了类似问题，不过我是做菌落PCR时有目的条带，比较亮，但是接菌摇瓶培养提质粒后用质粒跑电泳时只有一片拖尾式的区域，请问你明白么？
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10楼2014-05-06 13:42:13
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