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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr目的条带出现杂带，是什么原因？
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coolcdh

铁虫 (初入文坛)

[求助] pcr目的条带出现杂带，是什么原因？已有6人参与

红线上条带应该是目的条带（目的基因引物是生工免费合成的）出现的位置（从左到右梯度50,52,54,55,56,58），但是目的基因杂带太多了。为了说明操作没有问题，图中红箭和圆圈头分别是我们课题组前期已经证实好用的另一基因和GAPDH内参，另一基因和内参出现的位置正确。Marker是1000bp，产物大小是362bp。
一，        操作应该没有问题，不然另一基因和内参也不会ok，
二，        是不是目的基因引物的问题呢？我的pcr条件是：预变性94度5min，（变性94度30s、退火梯度50,52,54,55,56,58，时间30s、延伸72度30s，35cycles），延伸72度10min
pcr目的条带出现杂带，是什么原因？
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1楼2014-01-18 23:59:05
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yyshpy007

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
9楼2014-01-20 11:45:53
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半生一梦

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by coolcdh at 2014-01-19 23:29:55
要不切胶回收连载体再转化感受态呗?是什么意思，我是新手，刚上手半个月啊。...

就是说 把你的目的条带切胶回收之后 连接到载体上（你这种情况T载体应该就ok了） 然后转化到大肠杆菌感受态细胞里 挑选阳性克隆之后可以测序啊怎么滴
非常基础的步骤 也很简单 上手也会很快
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10楼2014-01-20 16:08:12
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普通回帖

yyshpy007

禁虫 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2014-01-19 19:34:13
本帖内容被屏蔽
2楼2014-01-19 00:09:55
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半生一梦

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2014-01-19 19:34:20
应该是引物特异性不够高啊 要不重新选一对引物
要不切胶回收连载体再转化感受态呗 就是稍麻烦
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3楼2014-01-19 15:18:01
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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看样子应该是引物的特异性不够高吧  如果是做克隆的话  回收一下就行了吧
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4楼2014-01-19 21:21:06
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以上NCBI 用primer blast 看一下，是不是引物特异性不好？
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5楼2014-01-19 23:04:41
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coolcdh

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yyshpy007 at 2014-01-19 00:09:55
58度左右特异性还可以吧，可以回收克隆了吧，有必要做的那么纯么

问题是;我不确定此条带是非特异条带还是我要的条带，万一是非特异性条带，或者说此细胞株并不表达此基因，那我后续的实验干扰什么的，就恐怕浪费时间了。虽然有文献支持此细胞株有我的目的基因表达（rt-qPCR）
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6楼2014-01-19 23:28:26
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coolcdh

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 半生一梦 at 2014-01-19 15:18:01
应该是引物特异性不够高啊 要不重新选一对引物
要不切胶回收连载体再转化感受态呗 就是稍麻烦

要不切胶回收连载体再转化感受态呗?是什么意思，我是新手，刚上手半个月啊。
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7楼2014-01-19 23:29:55
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木vs木

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物的特异性不好，提高一下退火温度

[ 发自小木虫客户端 ]
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坚持就是胜利！
8楼2014-01-20 04:13:46
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