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ap

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR产物杂带很多，主带很弱。如何进行下一步实验？ 已有4人参与

在真菌基因组中，PCR一段6kb基因，PCR结果PCR产物杂带很多，主带很弱。
想得到这段基因。是否可以提高退火温度，以这次的PCR产物为模板，进行再一次的PCR？
如果切胶回收，主带很弱（几乎不可见），会不会得不到回收产物？
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1楼 2010-07-22 13:55:00
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sunyongle1

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
ap(金币+10): 2010-07-22 16:06:40
如果你的引物可以的话，可以提高退火温度。另外不建议以pcr产物进行再次扩增，因为你的杂带大部分也是带有正确的引物序列。倒是可以试试切胶回收后再扩增，不过这样以来，你测序必然会有好多错的碱基。
还是直接切胶回收吧，看不见不见得就没有。只是量很少，但是可以直接连载体。
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2楼2010-07-22 13:59:04
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by sunyongle1 at 2010-07-22 13:59:04:
如果你的引物可以的话，可以提高退火温度。另外不建议以pcr产物进行再次扩增，因为你的杂带大部分也是带有正确的引物序列。倒是可以试试切胶回收后再扩增，不过这样以来，你测序必然会有好多错的碱基。
还是直接 ...

谢谢你的回答。
我的引物退火温度高了就没有PCR产物了。
我用的酶保真性比较高，切胶回收，再进行一次PCR，会有保真性的问题吗？
另外请问：切胶回收直接用EB染色可以吗？
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3楼2010-07-22 14:02:58
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sunyongle1

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
酶保真性比较高的话，问题不太大，多挑几个克隆就是了。但是6kb挺长的，即使保真性再好的酶也有可能错一两个碱基
切胶回收可以直接用EB染色
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4楼2010-07-22 14:09:16
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by sunyongle1 at 2010-07-22 14:09:16:
酶保真性比较高的话，问题不太大，多挑几个克隆就是了。但是6kb挺长的，即使保真性再好的酶也有可能错一两个碱基
切胶回收可以直接用EB染色

谢谢，EB染色后，切胶回收，然后作为PCR模板，不会有问题吧？
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5楼2010-07-22 15:23:46
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sunyongle1

木虫 (正式写手)
不会有问题
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6楼2010-07-22 15:26:43
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by sunyongle1 at 2010-07-22 15:26:43:
不会有问题

非常感谢！
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7楼2010-07-22 16:05:23
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带头大哥

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用高保真酶，PCR仪热启动。割胶时看不见的话，连上去基本也
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为家人为自己，努力
8楼2010-07-22 16:39:15
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ronghuan

银虫 (小有名气)
条带太弱的话，不建议胶回收，效果不好。建议还是调节下PCR反应条件
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9楼2010-07-22 20:32:43
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