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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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ap

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR产物杂带很多,主带很弱。如何进行下一步实验? 已有4人参与

在真菌基因组中,PCR一段6kb基因,PCR结果PCR产物杂带很多,主带很弱。
想得到这段基因。是否可以提高退火温度,以这次的PCR产物为模板,进行再一次的PCR?
如果切胶回收,主带很弱(几乎不可见),会不会得不到回收产物?
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sunyongle1

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
ap(金币+10): 2010-07-22 16:06:40
如果你的引物可以的话,可以提高退火温度。另外不建议以pcr产物进行再次扩增,因为你的杂带大部分也是带有正确的引物序列。倒是可以试试切胶回收后再扩增,不过这样以来,你测序必然会有好多错的碱基。
还是直接切胶回收吧,看不见不见得就没有。只是量很少,但是可以直接连载体。
2楼2010-07-22 13:59:04
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ap

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by sunyongle1 at 2010-07-22 13:59:04:
如果你的引物可以的话,可以提高退火温度。另外不建议以pcr产物进行再次扩增,因为你的杂带大部分也是带有正确的引物序列。倒是可以试试切胶回收后再扩增,不过这样以来,你测序必然会有好多错的碱基。
还是直接 ...

谢谢你的回答。
我的引物退火温度高了就没有PCR产物了。
我用的酶保真性比较高,切胶回收,再进行一次PCR,会有保真性的问题吗?
另外请问:切胶回收直接用EB染色可以吗?
3楼2010-07-22 14:02:58
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sunyongle1

木虫 (正式写手)


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酶保真性比较高的话,问题不太大,多挑几个克隆就是了。但是6kb挺长的,即使保真性再好的酶也有可能错一两个碱基
切胶回收可以直接用EB染色
4楼2010-07-22 14:09:16
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ap

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by sunyongle1 at 2010-07-22 14:09:16:
酶保真性比较高的话,问题不太大,多挑几个克隆就是了。但是6kb挺长的,即使保真性再好的酶也有可能错一两个碱基
切胶回收可以直接用EB染色

谢谢,EB染色后,切胶回收,然后作为PCR模板,不会有问题吧?
5楼2010-07-22 15:23:46
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sunyongle1

木虫 (正式写手)

不会有问题
6楼2010-07-22 15:26:43
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ap

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by sunyongle1 at 2010-07-22 15:26:43:
不会有问题

非常感谢!
7楼2010-07-22 16:05:23
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带头大哥

铁虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
用高保真酶,PCR仪热启动。割胶时看不见的话,连上去基本也
为家人为自己,努力
8楼2010-07-22 16:39:15
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ronghuan

银虫 (小有名气)

条带太弱的话,不建议胶回收,效果不好。建议还是调节下PCR反应条件
9楼2010-07-22 20:32:43
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