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qiannianchao

金虫 (初入文坛)

[求助] SOE pcr目的条带很暗,非特异条带很亮?

引物12:1000bp左右;
引物34:500bp左右;
重叠部分长度:40bp左右;
反应条件:50-52℃退火45s,延伸7min,一开始10-15个循环,然后加了1和4引物,30-40个循环;
得到的电泳结果总是:出现非特异性条带,大小600bp左右,而且很亮!但是目的条带处却很暗,无法回收。
请教高手这种情况是什么原因造成的,需要怎么样改善,在线等待。。
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-06 19:01:10
你是先进行10-15个循环以后再加上1和4引物的吗?这种没有做过,我们平时做的都是先分别将这两段产物P出来,纯化后按1:1比例混合作模板,再用全长的引物扩增,没有出现过你说的那种情况。
2楼2012-06-06 16:49:48
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qiannianchao

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-06-06 16:49:48
你是先进行10-15个循环以后再加上1和4引物的吗?这种没有做过,我们平时做的都是先分别将这两段产物P出来,纯化后按1:1比例混合作模板,再用全长的引物扩增,没有出现过你说的那种情况。

我们也是先将两端产物回收后,先进行10-15个循环的pcr,再加全长引物扩增的,引物设计检查了几遍,没有什么问题,难道是退火温度或者是延伸时间不够?
3楼2012-06-06 17:03:31
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beer胖

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-14 14:01:51
qiannianchao: 金币+2, ★★★很有帮助, 你的方法可以,金币给你 2012-07-25 16:48:17
延伸时间怎么会这么长?7min?
可以多试几个退火温度试试看
另外,你回收两个片段的时候最后一步是用试剂盒里的elution buffer溶解的还是用无菌水?一定要用水洗。
祝好运
4楼2012-06-07 14:25:24
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qiannianchao

金虫 (初入文坛)

已经出来结果了,谢谢
5楼2012-06-14 12:44:25
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quietorange

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by qiannianchao at 2012-06-14 12:44:25
已经出来结果了,谢谢

能说说最后怎么做出来的吗?我现在遇到同样的问题,虽然有目的条带,但是非特异性带和smear都挺严重的。
6楼2012-06-27 16:47:30
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jiuzi59

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

smear都挺严重的的话一般和引物设计有关,我做的PCR产物不纯化,效果也非常好的。你的重叠后的片段才1.5kb,应该很好P啊。
7楼2012-06-29 06:55:05
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qiannianchao

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by quietorange at 2012-06-27 16:47:30
能说说最后怎么做出来的吗?我现在遇到同样的问题,虽然有目的条带,但是非特异性带和smear都挺严重的。...

我最后加的无菌水
8楼2012-07-25 16:45:03
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qsx04152006

木虫 (知名作家)

楼主给个联系方式啊,好向你请教soepcr怎么设计引物啊,具体怎么连接啊?
9楼2013-09-02 12:56:50
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qsx04152006

木虫 (知名作家)

请问:soepcr怎么设计引物啊,基因1和基因2各设计两个引物a、b和c、d,其中b引物右端是含有基因2 的引物还是含有基因2的5“端序列,同理,引物C 5”端是含有基因1的下游引物还是含有基因1的序列?谢谢。
10楼2013-09-02 13:04:01
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