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qiannianchao

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[求助] SOE pcr目的条带很暗，非特异条带很亮？

引物12:1000bp左右；
引物34:500bp左右；
重叠部分长度：40bp左右；
反应条件：50-52℃退火45s，延伸7min，一开始10-15个循环，然后加了1和4引物，30-40个循环；
得到的电泳结果总是：出现非特异性条带，大小600bp左右，而且很亮！但是目的条带处却很暗，无法回收。
请教高手这种情况是什么原因造成的，需要怎么样改善，在线等待。。

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1楼 2012-06-06 14:42:09

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小猫三两只

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【答案】应助回帖

★
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西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-06 19:01:10

你是先进行10－15个循环以后再加上1和4引物的吗？这种没有做过，我们平时做的都是先分别将这两段产物P出来，纯化后按1：1比例混合作模板，再用全长的引物扩增，没有出现过你说的那种情况。

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2楼2012-06-06 16:49:48

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qiannianchao

金虫 (初入文坛)

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2楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-06-06 16:49:48
你是先进行10－15个循环以后再加上1和4引物的吗？这种没有做过，我们平时做的都是先分别将这两段产物P出来，纯化后按1：1比例混合作模板，再用全长的引物扩增，没有出现过你说的那种情况。

我们也是先将两端产物回收后，先进行10-15个循环的pcr，再加全长引物扩增的，引物设计检查了几遍，没有什么问题，难道是退火温度或者是延伸时间不够？

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3楼2012-06-06 17:03:31

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