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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SOE pcr目的条带很暗，非特异条带很亮？
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qiannianchao

金虫 (初入文坛)

[求助] SOE pcr目的条带很暗，非特异条带很亮？

引物12:1000bp左右；
引物34:500bp左右；
重叠部分长度：40bp左右；
反应条件：50-52℃退火45s，延伸7min，一开始10-15个循环，然后加了1和4引物，30-40个循环；
得到的电泳结果总是：出现非特异性条带，大小600bp左右，而且很亮！但是目的条带处却很暗，无法回收。
请教高手这种情况是什么原因造成的，需要怎么样改善，在线等待。。
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1楼 2012-06-06 14:42:09
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-06 19:01:10
你是先进行10－15个循环以后再加上1和4引物的吗？这种没有做过，我们平时做的都是先分别将这两段产物P出来，纯化后按1：1比例混合作模板，再用全长的引物扩增，没有出现过你说的那种情况。
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2楼2012-06-06 16:49:48
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qiannianchao

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-06-06 16:49:48
你是先进行10－15个循环以后再加上1和4引物的吗？这种没有做过，我们平时做的都是先分别将这两段产物P出来，纯化后按1：1比例混合作模板，再用全长的引物扩增，没有出现过你说的那种情况。

我们也是先将两端产物回收后，先进行10-15个循环的pcr，再加全长引物扩增的，引物设计检查了几遍，没有什么问题，难道是退火温度或者是延伸时间不够？
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3楼2012-06-06 17:03:31
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beer胖

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-14 14:01:51
qiannianchao: 金币+2, ★★★很有帮助, 你的方法可以，金币给你 2012-07-25 16:48:17
延伸时间怎么会这么长？7min？
可以多试几个退火温度试试看
另外，你回收两个片段的时候最后一步是用试剂盒里的elution buffer溶解的还是用无菌水？一定要用水洗。
祝好运
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4楼2012-06-07 14:25:24
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qiannianchao

金虫 (初入文坛)
已经出来结果了，谢谢
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5楼2012-06-14 12:44:25
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quietorange

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by qiannianchao at 2012-06-14 12:44:25
已经出来结果了，谢谢

能说说最后怎么做出来的吗？我现在遇到同样的问题，虽然有目的条带，但是非特异性带和smear都挺严重的。
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6楼2012-06-27 16:47:30
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jiuzi59

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

smear都挺严重的的话一般和引物设计有关，我做的PCR产物不纯化，效果也非常好的。你的重叠后的片段才1.5kb，应该很好P啊。
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7楼2012-06-29 06:55:05
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qiannianchao

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by quietorange at 2012-06-27 16:47:30
能说说最后怎么做出来的吗？我现在遇到同样的问题，虽然有目的条带，但是非特异性带和smear都挺严重的。...

我最后加的无菌水
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8楼2012-07-25 16:45:03
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qsx04152006

木虫 (知名作家)
楼主给个联系方式啊，好向你请教soepcr怎么设计引物啊，具体怎么连接啊？
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9楼2013-09-02 12:56:50
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qsx04152006

木虫 (知名作家)
请问：soepcr怎么设计引物啊，基因1和基因2各设计两个引物a、b和c、d，其中b引物右端是含有基因2 的引物还是含有基因2的5“端序列，同理，引物C 5”端是含有基因1的下游引物还是含有基因1的序列？谢谢。
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10楼2013-09-02 13:04:01
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