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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr切单一目的带回收后电泳出现两条带，再切目的带回收电泳还是两条带
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seaka

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr切单一目的带回收后电泳出现两条带，再切目的带回收电泳还是两条带 已有1人参与

最近做pcr，扩增出目的带（较浅，2000多）及其他杂带（其中一条约1800，非常亮，咋一看以为是目的带）
切单一目的带胶回收后直接电泳，又出现两条带，即目的带(浅）和杂带（约1800那条，亮）
不死心，再切目的带回收，继续电泳还是一模一样两条带
第三次再回收，杂带还是很坚挺，目的带就没有了。。。。。

把第一次和第二次回收产物当模板做PCR,跑胶再看，1800的杂带还是很亮，目的带依旧很浅。

这会是什么原因呢，如果是PCR后再出现杂带好解释，明明跑开了两条带，切单一的回收直接电泳，就应该是单一条带啊。

求解惑，谢谢啦!
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1楼 2013-08-29 23:27:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

merely

新虫 (小有名气)
我也遇到了楼主一样的问题。到底是怎么回事呢？楼主的问题解决了吗？
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我的宝贝http://shop125224422.taobao.com/
8楼2013-10-25 14:10:39
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ninjakiss

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
seaka(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-31 09:32:29
你遇上的这个问题好奇怪。。不过按道理来说，我一般胶回收的时候常常是回收亮的条带，较暗的一般按照杂带处理。所以比起你问的问题，我更觉得你也许换一下引物，摸一下最佳条件比较好。
本身切条带，我有的时候回收不回来，但是真没见到过你这个情况。我认为可能是你切的不是很整齐吧，可以多电泳一会，保证完整切下来目的条带为佳。有的时候可能会切成一个梯形，即上面你认为是你的目的条带，而下面较宽，粘连了较亮的杂带。我想到的只有这么多了。。。
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2楼2013-08-30 14:24:48
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-31 09:32:38
你的两条带是离的很近的，理论上是很难切开的，猜测是切胶时出的问题
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3楼2013-08-30 16:21:40
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seaka

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 大海一孤舟 at 2013-08-30 16:21:40
你的两条带是离的很近的，理论上是很难切开的，猜测是切胶时出的问题

肯定是能排除切错带的，中间正好隔着一条2000的mark指示带。不过谢谢啦！
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4楼2013-09-01 09:31:19
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seaka

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ninjakiss at 2013-08-30 14:24:48
你遇上的这个问题好奇怪。。不过按道理来说，我一般胶回收的时候常常是回收亮的条带，较暗的一般按照杂带处理。所以比起你问的问题，我更觉得你也许换一下引物，摸一下最佳条件比较好。
本身切条带，我有的时候回 ...

谢谢，肯定能排除切胶问题的。
引物是参考别人的，现在看来真的是非常不好，所以也是在自己设新的引物用了。
但出现的这个问题还是不能解决，很费解，更换了试剂盒，排除了试剂盒污染，特地清洁了切胶工具，也排除了工具的污染，实在想不出还有哪个环节出问题。
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5楼2013-09-01 09:34:59
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maidi12

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
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6楼2013-09-01 22:43:55
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seaka

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by maidi12 at 2013-09-01 22:43:55
你用的什么染色，或者缓冲液换了没有？建议你先换个浓度大一点的胶跑一下，看你的2000的条带是否是单一的

EB染色
缓冲液换了的，而且别人用同样的槽都没出现这个问题。
暂且不管两千的条带是否单一，是在大于2000MARK上切的，即使有杂带也不该跑到两千下面去吧，而且还那么亮。
目前还是费解。
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7楼2013-09-02 10:26:41
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yinchu1990

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我觉得是电泳液脏了的原因，建议换下
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9楼2013-10-25 14:22:00
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seaka

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yinchu1990 at 2013-10-25 14:22:00
我觉得是电泳液脏了的原因，建议换下

谢谢，不过不会的，因为同时带着其他样品做对照，是没问题的。另外电泳液保险起见，也换过了。
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10楼2013-10-28 16:21:26
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