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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DNA电泳后，空白对照总是出现一个弱条带，重赏！
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changhailin

新虫 (初入文坛)

[求助] DNA电泳后，空白对照总是出现一个弱条带，重赏！ 已有3人参与

小弟做的是Knock out小鼠的鉴定，如图1,2所示，最后一个是空白阴性对照，跑完后应该没有条带，但残酷的现实是MLGB的每次都出现一个弱条带，起初以为是污染了所以换了很多次体系，经过一段时间N次的换体系的折腾，还是有，MLGB的无语了。
大体过程为从小鼠尾部粗提DNA当cDNA模版，PCR后跑胶。 就是这阴性对照的弱条带，让我百思不得其解，求高手指点。重谢！

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1楼 2012-10-09 12:05:58
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

杜杜

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以更换mix试试，建议用takara的pre-mix。
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8楼2012-10-10 08:56:57
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changhailin

新虫 (初入文坛)
目的条带为200bp左右
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2楼2012-10-09 12:06:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
能说明一下你的空白对照是什么呢？是不是PCR时不加模板？还是什么其他的？还有可能是引物污染，不知道你检测了没有。
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3楼2012-10-09 14:59:38
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changhailin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-09 14:59:38
能说明一下你的空白对照是什么呢？是不是PCR时不加模板？还是什么其他的？还有可能是引物污染，不知道你检测了没有。

空白对照 就是CDNA换成水，把水当模版，引物没有污染这个很确定
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4楼2012-10-09 15:08:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

我想你已经检查过水了，此外检查下dNTP Mix。我建议就是把做PCR的那几个stock都换一下。
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5楼2012-10-09 15:30:53
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changhailin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-09 15:30:53
我想你已经检查过水了，此外检查下dNTP Mix。我建议就是把做PCR的那几个stock都换一下。

我用的是MIX的酶 loading都包含，只加引物 和水，和CDNA就跑PCR，求指点呀
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6楼2012-10-09 19:40:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-10 19:15:53
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6楼: Originally posted by changhailin at 2012-10-09 19:40:26
我用的是MIX的酶 loading都包含，只加引物 和水，和CDNA就跑PCR，求指点呀...

这样的话，如果水和引物都没事，会不会是你混合PCR体系的时候加cDNA时候污染的呀？你大概做了master mix吧，要先把master mix分别加到不同的PCR管/plate well里，然后再加cDNA. 如果反过来的话要格外小心，不要让枪头污染了。
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7楼2012-10-10 08:08:36
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changhailin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-10 08:08:36
这样的话，如果水和引物都没事，会不会是你混合PCR体系的时候加cDNA时候污染的呀？你大概做了master mix吧，要先把master mix分别加到不同的PCR管/plate well里，然后再加cDNA. 如果反过来的话要格外小心，不要让枪 ...

嗯  那肯定是先把mix,primer 混好了在分，污染这种低级错误不太可能。。 这块很注意的，所以很纠结呀
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9楼2012-10-10 09:31:58
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changhailin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 杜杜 at 2012-10-10 08:56:57
可以更换mix试试，建议用takara的pre-mix。

不是mix的问题  用同样的mix跑别的目的条带没问题  就跑这个有问题  难道和PCR条件有关？
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10楼2012-10-10 09:33:26
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