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笑笑打dota

金虫 (小有名气)

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[求助] 菌落PCR有目的条带，重组质粒提取PCR却没条带，请问是什么原因？已有3人参与

菌落PCR有目的条带，重组质粒PCR却没条带，然后提取质粒跑电泳，也没观察到重组之后大小的目的条带，有很多杂带，请问可能是什么原因啊？

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1楼 2014-03-20 15:54:30

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tu475575025

新虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
笑笑打dota(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 20:01:16
gyesang: 回帖置顶 2014-03-31 20:01:18

直接在平板上挑菌落是可能沾到平板上你转化时用的DNA，所以你p出来可能全是阳性。你一定要用菌体做pcr建议先挑出来在1.5ml ep管里少量（500ul左右）培养一点，再用菌体做pcr，或者直接做菌液pcr。另外，如果你的插入片段够大（1k以上）的话，你可以直接跑菌液电泳，以空质粒（不要用线性的哟）作对比，如果是阳性转化子，质粒会滞后（重组质粒比空质粒大）。
菌液电泳：裂解液为2%SDS和0.4M NaoH1：1混合
裂解液10ul+菌液20ul 裂解2-5min后加入2ul溴酚蓝，全部点孔（制大孔的胶，不要放在缓冲液中点），观察质粒滞后的转化子一般就是你的阳性。