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chengx1121

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教下RT-PCR空白对照为啥总有反应峰？

最近补实验空白对照总有反应峰，CT值跟正常样本都差不多，25上下就起峰了
看了下溶解峰，漂亮的很，连引物二聚体的影子都没有
我这是什么情况啊，该咋解决啊？

顺便再问下，各位读取CT值的基线一般怎么选啊？是默认还是自己调整？

这是我最近做的空白

这是溶解曲线



[ Last edited by chengx1121 on 2012-12-17 at 17:53 ]
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1楼2012-12-17 17:51:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
熔解曲线温度在80度以下的一般是引物二聚体。正常的峰在85度上下。此外，你的熔解曲线很乱啊。
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2楼2012-12-18 07:39:02
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stewart3261

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的扩增曲线有点晚！熔解曲线有些乱！你用的是什么扩增试剂盒，哪家公司的？我们以前也出现过这种情况，我们解决的办法是直接换掉关键的东西。后来试剂盒（扩增）也换了。结果就漂亮很多！
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3楼2012-12-18 09:28:25
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chengx1121

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-18 07:39:02
熔解曲线温度在80度以下的一般是引物二聚体。正常的峰在85度上下。此外，你的熔解曲线很乱啊。

问题是这个曲线是空白对照啊……昨天做了几个空白，扩增曲线和溶解曲线还有更漂亮的，我不好意思帖出来……
试剂换了一个遍，空白还是会出现反应
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4楼2012-12-18 13:02:16
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chengx1121

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-12-18 09:28:25
你的扩增曲线有点晚！熔解曲线有些乱！你用的是什么扩增试剂盒，哪家公司的？我们以前也出现过这种情况，我们解决的办法是直接换掉关键的东西。后来试剂盒（扩增）也换了。结果就漂亮很多！

图是空白对照，理论上应该更晚出现或者根本不出现，这峰太漂亮了，郁闷的难受啊！
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5楼2012-12-18 13:03:27
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by chengx1121 at 2012-12-18 13:02:16
问题是这个曲线是空白对照啊……昨天做了几个空白，扩增曲线和溶解曲线还有更漂亮的，我不好意思帖出来……
试剂换了一个遍，空白还是会出现反应...

空白对照有扩增并且溶解曲线峰在80度以下一般是引物二聚体了。可能是引物设计不是很好。
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6楼2012-12-18 13:37:21
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txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这么多曲线，哪个是空白的呢？还是都是啊？
你这个空白曾经有过这种情况么？
如果是第一次做就出现这种情况，可以说引物设计得很差。
当然还有一种可能，就是你的实验室曾经有人使用过相同的引物进行扩增，然后他跑过电泳或开过管，导致你的实验室大环境被污染，而造成空白出现扩增
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7楼2012-12-18 17:22:36
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chengx1121

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by txw87 at 2012-12-18 17:22:36
你这么多曲线，哪个是空白的呢？还是都是啊？
你这个空白曾经有过这种情况么？
如果是第一次做就出现这种情况，可以说引物设计得很差。
当然还有一种可能，就是你的实验室曾经有人使用过相同的引物进行扩增，然后 ...

都是空白，目前看，好像我的试剂污染了，别人在其他实验室做完全没有曲线试剂一样
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8楼2012-12-20 10:45:16
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是跑的内参的溶解曲线？如果内参的话是正常的，若不是内参的，很可能是你的目的基因未扩增出来，你设计的引物是有问题的，很可能是跟你的反转录试剂如oligodT或者是其他东西反应了
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9楼2012-12-20 11:30:10
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