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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

[求助] 为啥RT-PCR的空白对照也出现了目的条带? 已有2人参与

做RT-PCR时,为了保证不是RNA的质量问题引起的失败,在反转录时就做了空白对照,在一组PCR管中加的是无菌水代替RNA,其余条件均不变,最后用两组实验合成的cDNA做模板,进行PCR反应,反应体系及程序完全一样,最后扩增的结果如图一。左一和左三是加了RNA的,左二和左四是加无菌水代替RNA的,右一是marker,奇怪的是我的目的条带大概就在1000,这个结果差不多正确,1500bp的marker,但为啥加了无菌水代替RNA的也能出目的条带?
    而且,楼主当时举得marker有些没有跑开,把胶又拿回去跑,最后再进行检测,就出现了图二,左二和左四降解比较明显。
    对于这种结果,我真是醉了,现在完全不知道问题出在哪里,请求各位大神支招,谢谢!

为啥RT-PCR的空白对照也出现了目的条带?
2014.10.13PCR结果.jpg


为啥RT-PCR的空白对照也出现了目的条带?-1
2014.10.13PCR延长电泳时间后的结果.jpg
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喜欢生物,所以想好好研究下去!
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cnzpli

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-10-13 22:09:52
气溶胶污染。一些较常用的载体很容易产生气溶胶污染。我们实验室跑某些基因只要加了酶和引物就可以扩出来阳性条带。建议跑PCR之前对超净台和水彻底照紫外
2楼2014-10-13 17:08:27
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

引用回帖:
2楼: Originally posted by cnzpli at 2014-10-13 17:08:27
气溶胶污染。一些较常用的载体很容易产生气溶胶污染。我们实验室跑某些基因只要加了酶和引物就可以扩出来阳性条带。建议跑PCR之前对超净台和水彻底照紫外

能说跑胶都是在无菌台下开着紫外灯,把线弄出来跑的吗?就是怕污染,所以每个步骤很超级严格的。那这样出来的阳性条带可靠吗?
喜欢生物,所以想好好研究下去!
3楼2014-10-13 18:03:12
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cnzpli

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by wu-ke-da at 2014-10-13 18:03:12
能说跑胶都是在无菌台下开着紫外灯,把线弄出来跑的吗?就是怕污染,所以每个步骤很超级严格的。那这样出来的阳性条带可靠吗?...

有可能反转录时空白被污染了
你跑胶上样量有点大哦 可能会飘到旁边孔的 pcr加3到5微就够了

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-10-13 18:51:52
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

引用回帖:
4楼: Originally posted by cnzpli at 2014-10-13 18:51:52
有可能反转录时空白被污染了
你跑胶上样量有点大哦 可能会飘到旁边孔的 pcr加3到5微就够了
...

哦,一般上5ul,如果是被污染的话,我直接切胶回收应该没什么问题吧
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5楼2014-10-13 21:04:19
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cnzpli

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


wu-ke-da(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-14 10:55:11
引用回帖:
5楼: Originally posted by wu-ke-da at 2014-10-13 21:04:19
哦,一般上5ul,如果是被污染的话,我直接切胶回收应该没什么问题吧...

想知道到底是什么的话就分别切下来连接到通用载体上测序 结果都是你的目的片段的话就肯定是污染了

[ 发自小木虫客户端 ]
6楼2014-10-13 23:45:46
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

引用回帖:
6楼: Originally posted by cnzpli at 2014-10-13 23:45:46
想知道到底是什么的话就分别切下来连接到通用载体上测序 结果都是你的目的片段的话就肯定是污染了
...

好吧,只能这样了,虽然过程有点漫长
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7楼2014-10-14 11:09:14
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ting8907

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

8楼2014-10-29 17:36:10
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

引用回帖:
8楼: Originally posted by ting8907 at 2014-10-29 17:36:10
楼主你的结果处理的怎么样了呢?什么原因呢?我们也出现了类似的情况。。。

中间带本科实验耽误了一段时间,最近开始做,发现了更纠结的问题,条带都变下了,建议赶紧回收,送去测序就知道了,别再纠结了,相当于就多检测一个样,我就是犹豫了,弄得现在之前的条带都p不出来了
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9楼2014-10-30 08:34:05
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ting8907

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

10楼2014-10-30 10:03:26
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