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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

[求助] PCR有时能出来带有时出不来 已有8人参与

最近做一个PCR,很难做,要么能出来条带,很暗,要么完全看不到条带,试了各种体系,模板是上次同学P出来的,因为条带也暗,没有稀释过,反正出不来。偶尔一次用出来的条带再p,完全没有。想哭啊,现在模板都快用完了,怎么办呀。
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古木宁天

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-07-24 21:24:11
确定延伸时间足够?
2楼2014-07-24 18:09:20
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 古木宁天 at 2014-07-24 18:09:20
确定延伸时间足够?

嗯是的,而且普通PCR出不来,我用的是TD
3楼2014-07-24 18:21:10
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
泡菜肉丝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-28 11:14:37
你的模板有测过浓度么?是否测序过?上次p出来的条带暗的话,很有可能模板本身就有问题。你同学的条带也并不一定可信。
下次再见面的时候,我们一定会笑着相遇吧
4楼2014-07-24 19:54:55
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-24 19:54:55
你的模板有测过浓度么?是否测序过?上次p出来的条带暗的话,很有可能模板本身就有问题。你同学的条带也并不一定可信。

关键是只有他的东西了为模板了,我给别人做呢,没测过浓度,也没测序过。
5楼2014-07-24 20:21:03
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-07-24 22:42:19
引用回帖:
5楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-24 20:21:03
关键是只有他的东西了为模板了,我给别人做呢,没测过浓度,也没测序过。...

没测过浓度也没测序,就拿来做模板么。。。
实在不行,就换用好的聚合酶吧。

还有一个方法,是连接到亚克隆载体上,然后转化感受态提质粒再用来做模板,不过要是你的模板不够的话就不好说了。

没有其他的模板么?只要是有表达的基因,总可以用cDNA来做模板的吧。
下次再见面的时候,我们一定会笑着相遇吧
6楼2014-07-24 20:51:14
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-24 20:51:14
没测过浓度也没测序,就拿来做模板么。。。
实在不行,就换用好的聚合酶吧。

还有一个方法,是连接到亚克隆载体上,然后转化感受态提质粒再用来做模板,不过要是你的模板不够的话就不好说了。

没有其 ...

嗯,我之前也想过连T载体,但是有条杂带比目的条带亮,感觉行不通。这个模板好像是他们做重叠pcr得到的,所以要没有的话只能重新再来,很郁闷的说,关键这不是我的东西,这么不顺利感觉压力好大呀。
7楼2014-07-24 22:03:56
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-24 22:03:56
嗯,我之前也想过连T载体,但是有条杂带比目的条带亮,感觉行不通。这个模板好像是他们做重叠pcr得到的,所以要没有的话只能重新再来,很郁闷的说,关键这不是我的东西,这么不顺利感觉压力好大呀。...

他们自己做完居然不测浓度也不测序,相当不靠谱诶。。。

要是模板量还有些的话就试试连载体吧,然后做菌液PCR找你要的条带,阳性菌落的比例估计会比较低但也不是不可行。

还有就是你用的是什么聚合酶?最好用好一些的,然后查查你的序列GC含量高不,哪怕只是有一段GC重复比较多的,都有可能会影响你的PCR。如果是因为GC含量,可以试着加GC enhancer,会有帮助的。我以前有遇到过目的基因中间有一段大量GC重复序列,很难扩增出特异性产物,扩出来也经常丢碱基。后来加了GC enhancer就解决了,你也可以试一下。
下次再见面的时候,我们一定会笑着相遇吧
8楼2014-07-25 02:09:16
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-25 02:09:16
他们自己做完居然不测浓度也不测序,相当不靠谱诶。。。

要是模板量还有些的话就试试连载体吧,然后做菌液PCR找你要的条带,阳性菌落的比例估计会比较低但也不是不可行。

还有就是你用的是什么聚合酶?最好用 ...

我突然想到这个模板是不是要稀释呀?因为我一直觉得模板浓度不高所以也没稀释,但是看他们之前P出的条带不是现在的模板,但是据他们说那个模板几乎看不到目的条带,而我昨天看了下现在的模板,条带虽然不亮但还是很清晰的,会不会是问题在这儿?

至于连载体我还是觉得不行,主要下面那条杂带比目的条带多,我得阳性菌落很难找到

我用的是TAq和pfu,你说的GC含量这块儿是没注意过,从来没遇到这样的问题。

总之很感谢,你分析的方法很有用啊,谢谢
9楼2014-07-25 09:35:08
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-25 09:35:08
我突然想到这个模板是不是要稀释呀?因为我一直觉得模板浓度不高所以也没稀释,但是看他们之前P出的条带不是现在的模板,但是据他们说那个模板几乎看不到目的条带,而我昨天看了下现在的模板,条带虽然不亮但还是很 ...

哈哈,应该的嘛。我昨天也一直忘了说,就算他们没测浓度你自己还是可以拿去nanodrop上测一下的嘛。不过你说条带暗的话应该浓度不会太高,一般100-200ng就可以看到清晰的条带的,这个量用来做模版足够了。你跑胶看模版的时候也可以根据ladder的亮度稍微推测下,看你的目的条带大概有多少。

问题解决了的话也最好能说一声哦,希望你的实验顺利。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
下次再见面的时候,我们一定会笑着相遇吧
10楼2014-07-25 09:53:20
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