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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

[求助] PCR有时能出来带有时出不来 已有8人参与

最近做一个PCR，很难做，要么能出来条带，很暗，要么完全看不到条带，试了各种体系，模板是上次同学P出来的，因为条带也暗，没有稀释过，反正出不来。偶尔一次用出来的条带再p，完全没有。想哭啊，现在模板都快用完了，怎么办呀。
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1楼 2014-07-24 17:50:57
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古木宁天

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-24 21:24:11
确定延伸时间足够？
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懒
2楼2014-07-24 18:09:20
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 古木宁天 at 2014-07-24 18:09:20
确定延伸时间足够？

嗯是的，而且普通PCR出不来，我用的是TD
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3楼2014-07-24 18:21:10
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
泡菜肉丝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-28 11:14:37
你的模板有测过浓度么？是否测序过？上次p出来的条带暗的话，很有可能模板本身就有问题。你同学的条带也并不一定可信。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
4楼2014-07-24 19:54:55
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-24 19:54:55
你的模板有测过浓度么？是否测序过？上次p出来的条带暗的话，很有可能模板本身就有问题。你同学的条带也并不一定可信。

关键是只有他的东西了为模板了，我给别人做呢，没测过浓度，也没测序过。
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5楼2014-07-24 20:21:03
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-24 22:42:19
引用回帖:
5楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-24 20:21:03
关键是只有他的东西了为模板了，我给别人做呢，没测过浓度，也没测序过。...

没测过浓度也没测序，就拿来做模板么。。。
实在不行，就换用好的聚合酶吧。

还有一个方法，是连接到亚克隆载体上，然后转化感受态提质粒再用来做模板，不过要是你的模板不够的话就不好说了。

没有其他的模板么？只要是有表达的基因，总可以用cDNA来做模板的吧。
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6楼2014-07-24 20:51:14
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-24 20:51:14
没测过浓度也没测序，就拿来做模板么。。。
实在不行，就换用好的聚合酶吧。

还有一个方法，是连接到亚克隆载体上，然后转化感受态提质粒再用来做模板，不过要是你的模板不够的话就不好说了。

没有其 ...

嗯，我之前也想过连T载体，但是有条杂带比目的条带亮，感觉行不通。这个模板好像是他们做重叠pcr得到的，所以要没有的话只能重新再来，很郁闷的说，关键这不是我的东西，这么不顺利感觉压力好大呀。
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7楼2014-07-24 22:03:56
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-24 22:03:56
嗯，我之前也想过连T载体，但是有条杂带比目的条带亮，感觉行不通。这个模板好像是他们做重叠pcr得到的，所以要没有的话只能重新再来，很郁闷的说，关键这不是我的东西，这么不顺利感觉压力好大呀。...

他们自己做完居然不测浓度也不测序，相当不靠谱诶。。。

要是模板量还有些的话就试试连载体吧，然后做菌液PCR找你要的条带，阳性菌落的比例估计会比较低但也不是不可行。

还有就是你用的是什么聚合酶？最好用好一些的，然后查查你的序列GC含量高不，哪怕只是有一段GC重复比较多的，都有可能会影响你的PCR。如果是因为GC含量，可以试着加GC enhancer，会有帮助的。我以前有遇到过目的基因中间有一段大量GC重复序列，很难扩增出特异性产物，扩出来也经常丢碱基。后来加了GC enhancer就解决了，你也可以试一下。
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8楼2014-07-25 02:09:16
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-25 02:09:16
他们自己做完居然不测浓度也不测序，相当不靠谱诶。。。

要是模板量还有些的话就试试连载体吧，然后做菌液PCR找你要的条带，阳性菌落的比例估计会比较低但也不是不可行。

还有就是你用的是什么聚合酶？最好用 ...

我突然想到这个模板是不是要稀释呀？因为我一直觉得模板浓度不高所以也没稀释，但是看他们之前P出的条带不是现在的模板，但是据他们说那个模板几乎看不到目的条带，而我昨天看了下现在的模板，条带虽然不亮但还是很清晰的，会不会是问题在这儿？

至于连载体我还是觉得不行，主要下面那条杂带比目的条带多，我得阳性菌落很难找到

我用的是TAq和pfu，你说的GC含量这块儿是没注意过，从来没遇到这样的问题。

总之很感谢，你分析的方法很有用啊，谢谢
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9楼2014-07-25 09:35:08
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-25 09:35:08
我突然想到这个模板是不是要稀释呀？因为我一直觉得模板浓度不高所以也没稀释，但是看他们之前P出的条带不是现在的模板，但是据他们说那个模板几乎看不到目的条带，而我昨天看了下现在的模板，条带虽然不亮但还是很 ...

哈哈，应该的嘛。我昨天也一直忘了说，就算他们没测浓度你自己还是可以拿去nanodrop上测一下的嘛。不过你说条带暗的话应该浓度不会太高，一般100-200ng就可以看到清晰的条带的，这个量用来做模版足够了。你跑胶看模版的时候也可以根据ladder的亮度稍微推测下，看你的目的条带大概有多少。

问题解决了的话也最好能说一声哦，希望你的实验顺利。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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10楼2014-07-25 09:53:20
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