| 查看: 2402 | 回复: 5 | ||||
[求助]
反转录后PCR无条带
|
|
我多次提取RNA OD值一直在1.4-1.6之间，反转录后扩增条带均无发发扩初目的条带来。 另外我想知道反转录的cDNA能不通过PCR后检测吗，也就是反转录好了直接跑胶！ 目的条带长670bp，Tm值为 59.58,56.84℃，卧我采用的是53度。 体系是： 水 14.4 buffer 2 (2.5μM)dNTP 1.6 cDNA 1 (10μM)引物 各 0.4 酶 0.2  [ Last edited by tanxi125 on 2011-7-21 at 18:06 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 核酸生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
93BebMhtakh前后11位开头都是大写
已经有5人回复
-
欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律
已经有86人回复
-
感觉是下周放榜了
已经有11人回复
-
filecode=后面第一个是大写字母
已经有10人回复
-
时间戳变了，能看出什么问题？
已经有4人回复
-
哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？
已经有15人回复
-
今天系统多次维护，明天很可能放榜！
已经有9人回复
-
时间戳又变了8-15
已经有25人回复
-
2027广东省杰青
已经有6人回复
-
快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 反转录之后PCR扩增片段问题的请教，急急急
已经有5人回复
- 请教RNA提取高手：反转录PCR（RT-PCR)中DNA的去除
已经有18人回复
- 反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求
已经有298人回复
- 提RNA反转录后，用GAPDH和TLR进行PCR，可是GAPDH条带很亮，TLR怎么都出不来
已经有14人回复
- NanoDrop和Agilent 2100 bioanalyzer检测RNA浓度有多大差异
已经有10人回复
- 菌落PCR无条带
已经有19人回复
- 关于RNA以及cDNA电泳问题，拜求各位大侠指点
已经有10人回复
- PCR无任何条带，完全是空白胶
已经有15人回复
- PCR后凝胶电泳条带时有时无是怎么回事？
已经有5人回复
- 【求助/交流】实时定量内参无条带！
已经有7人回复
- 【求助/交流】PCR后没有目的条带，有非特异性条带，求解决办法？？
已经有20人回复
- 【求助/交流】PCR扩增后没有条带是怎么回事?
已经有5人回复
- 【求助/交流】DGGE 胶回收后做PCR没有条带是怎么回事？？急！！！
已经有36人回复
- 【求助/交流】PCR引物设计出来了，但酶切之后电泳没条带啊
已经有18人回复
gaoyang636
木虫 (著名写手)
- BioEPI: 17
- 应助: 202 (大学生)
- 金币: 4111.4
- 散金: 7
- 红花: 14
- 帖子: 1108
- 在线: 159.8小时
- 虫号: 384065
- 注册: 2007-05-27
- 专业: 基因组学
2楼2011-07-21 19:18:25
zhengfan1109
银虫 (正式写手)
- BioEPI: 2
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1663.6
- 散金: 565
- 红花: 6
- 帖子: 602
- 在线: 309.3小时
- 虫号: 255973
- 注册: 2006-05-28
- 专业: 细胞周期与调控
3楼2011-07-21 19:40:45
4楼2011-07-21 19:41:20
zhengfan1109
银虫 (正式写手)
- BioEPI: 2
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1663.6
- 散金: 565
- 红花: 6
- 帖子: 602
- 在线: 309.3小时
- 虫号: 255973
- 注册: 2006-05-28
- 专业: 细胞周期与调控
5楼2011-07-21 19:42:53
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - BioEPI: 11
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
|
反向PCR操作应该注意 1.分离的基因组DNA应该达到一定纯度，以利用后面的酶切、连接盒PCR扩增。还要足以用超滤方法除去乙醇，不然连接反应会有困难。DNA溶解于TE缓冲溶液中，pH=8.0。 2.基因组DNA的复杂程度不要太高，一般大于10的9次方的基因组需要构建一些小一些的基因文库。 3.对于限制性内切酶的选择有一定要求。（1）一般需要限制性内切酶需要把DNA切割为2-3Kb的片段，作为反向PCR扩增片段比较好，如果太短可能因为要扩增的DNA序列中相当部分是未知序列（因为也没有必要去测序，要是对于需要扩增的DNA全部序列都测定出来了，那就不用做反向PCR了），无法提供做够的PCR扩增的信息，连接时可能也会有麻烦出现；太长了反向PCR扩增反应体系可能无法有效完成。貌似长片段PCR体系尚未有效应用于反向PCR。（2）限制性内切酶在选择时要考虑DNA扩增片段的G+C 的含量。（3）酶切反应时尽量保证在限制性内切酶的最适反应条件下进行，以避免星号活性出现。商业用酶试剂经常还有相当数量的甘油，在酶切反应前一般应该用超滤去除掉甘油，然后再加入有关酶的缓冲溶液，这不就用不着使用分子筛更换缓冲溶液的操作了，除非实验者的确非常急于练习使用分子筛更换缓冲溶液的操作，而且正好有现成的已经转配好的层析柱。  （4）一般地，粘性末端的连接效率高于平头末端连接很多。4.被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化。 T4 DNA Ligase即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。同时T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。T4DNA连接酶在分子生物学中有广泛的应用。 被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化反应体系： 10X连接酶缓冲溶液： 10μL（购买T4 DNA Ligase商家会提供，使用时稀释10倍）,限制性内切酶DNA片段：5μL（溶解于TE缓冲溶液中，pH=8.0）， T4 DNA 连接酶 ：1μL， 无菌水： 84μL 限制性内切酶DNA片段终浓度一般不超过 3ng/μL，反应体系中的T4 DNA 连接酶用量可按产品说明书配制，一般对于上述反应体系而言，2.5U 的T4 DNA 连接酶足够了。被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化反应体系可在14摄氏度的水浴中过夜（大概13-18小时），然后升温至约65摄氏度使T4 DNA 连接酶失活已终止反应。很多书上对于自身环化反应的试验流程说的不清楚，所以我完整写出来，以供参考。当然也文献上说：被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化仅需要在16摄氏度水浴中1小时即可升温至约65摄氏度使T4 DNA 连接酶失活已终止反应。 （5）一般而言，被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化后，还是需要用新的针对于已知序列的那部分DNA片段进行再次限制性酶切，形成新的已知序列的那部分DNA片段在外侧的线状DNA，这样PCR就变成普通的PCR，效率会比直接对于环形DNA模板要高，因为至少环状DNA要考虑到DNA由于螺旋压紧而形成的复制阻力，PCR反应可是没有DNA拓扑异构酶来消除由于螺旋压紧而形成的复制阻力，也没有证据表明任何被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化后都会有足够的左手螺旋足以克服由于螺旋压紧而形成的复制阻力。 （6）第一轮PCR之后，用电泳检测，如果目标带不够窄和量，或有杂带出现，一般需要进行嵌套PCR再次扩增，需要至少一个不同于第一次PCR的引物的新引物。 |
6楼2014-07-17 03:11:01
