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foreverjohn

金虫 (小有名气)

[交流] NanoDrop和Agilent 2100 bioanalyzer检测RNA浓度有多大差异

我最经用NanoDrop测量的RNA浓度比之前在Agilent 2100 bioanalyzer测量的浓度低接近一半，请问这正常吗？如果RNA降解，对浓度测量有很大影响吗？据我所知，即使变成单核苷酸，也是相似的紫外吸收谱，对浓度的测量是没有影响的。有经验的虫子解释下
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1楼 2011-12-29 14:19:52
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回帖置顶 ( 共有2个 )

gaoyang636

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
foreverjohn(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+4, MolEPI+1): Good! 2011-12-29 16:51:06
首先得看你的RNA浓度，如果能到几百ng/ul，用nanodrop太足够了；
   但是如果浓度很低，比如：几ng/ul，得用2100,nanodrop此时结果不可信；
   并且RNA降解的话，你从2100的结果上就能够看出来，这个机器可不仅仅是定量用的。但是Nanodrop的确只是定量了……
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3楼2011-12-29 15:46:47
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longrna

新虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-12-31 22:17:05
wanhscn(金币+2, MolEPI+1): 热心！感谢专业的解答！ 2012-01-05 11:27:46
两种不同的检测方法（NanoDrop\aglient 2100）的确得出的结果不一样。
我也试过出来楼主这种情况。一般来说2100比nanodrop高一些，某次高一半，有时高10-30%
另外，aglient RNA 6000 nano kit不是检测25-500ng/ul吗？楼主何故用到1000ng/ul? 我一般按NanoDrop 200-300ng/ul的浓度上，峰图看起来挺好的。
而且我感觉好像aglient太敏感了，有时出不来RIN值，不知有没虫子遇到类似情况，希望多交流。
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6楼2011-12-30 09:28:33
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foreverjohn

金虫 (小有名气)
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2楼2011-12-29 14:21:52
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foreverjohn

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gaoyang636 at 2011-12-29 15:46:47:
首先得看你的RNA浓度，如果能到几百ng/ul，用nanodrop太足够了；
   但是如果浓度很低，比如：几ng/ul，得用2100,nanodrop此时结果不可信；
   并且RNA降解的话，你从2100的结果上就能够看出来，这个机器可不仅 ...

感谢回复，我的RNA浓度以前用Agilent 2100测量时浓度均大于1 ug/ul（多个样品），最近我使用时，先根据以前得到的浓度稀释至1 ug/ul，此时1 ul电泳检验RNA质量尚可，然后1 ul稀释10倍至10 ul，Nanodrop测量浓度只有50-60 ng/ul（多个样品均在这个值内），也就是说NanoDrop测量值（500-600 ng）只有Agilent 2100测量值得一半左右。不知道你是否遇到过这样的情况。
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4楼2011-12-29 23:18:19
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gaoyang636

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-12-31 22:16:45
引用回帖:
4楼: Originally posted by foreverjohn at 2011-12-29 23:18:19:
感谢回复，我的RNA浓度以前用Agilent 2100测量时浓度均大于1 ug/ul（多个样品），最近我使用时，先根据以前得到的浓度稀释至1 ug/ul，此时1 ul电泳检验RNA质量尚可，然后1 ul稀释10倍至10 ul，Nanodrop测量浓度只 ...

这时候你应该拿这几个稀释后的样品（即用来测Nanodrop的样品）测一下2100，与其考虑是不是RNA降解，不如考虑是不是稀释的时候出错了（枪不准，计算失误等等）；
  这才是control……
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5楼2011-12-30 08:33:45
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foreverjohn

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by longrna at 2011-12-30 09:28:33:
两种不同的检测方法（NanoDrop\aglient 2100）的确得出的结果不一样。
我也试过出来楼主这种情况。一般来说2100比nanodrop高一些，某次高一半，有时高10-30%
另外，aglient RNA 6000 nano kit不是检测25-500ng/ ...

aglient 2100检测时稀释到300ng左右，然后根据稀释倍数换算成浓度。按照您的经验，我的这个结果是正常现象。我要做反转录和Real-time PCR，要对样品进行定量，那么使用时该用哪个浓度比较合适呢？
NanoDrop确实可以测到200 ng/ul以上，但是由于我们组的仪器使用时间长了，可能有七八年？因此超过100 ng/ul就提示有气泡，可能是表面需要清洗，但是工程师又不给售后，所以我们现在一般都是100 ng/ul一下测量。
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7楼2011-12-31 22:15:39
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longrna

新虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+1): 鼓励积极交流哦 2012-01-05 10:53:08
做反转和Real-time PCR其实不用那么精确的定量吧？
agilent RNA 更多情况是用于检测RNA的完整性，RIN值。
根据实验室情况选择一种合适的定量方法再加上自己或师兄师姐们的经验就好了。 因为不同仪器定量结果是不一样的，如果纠结于此实验说不定难以进行了。
祝实验顺利！
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8楼2012-01-05 09:12:02
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foreverjohn

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by longrna at 2012-01-05 09:12:02:
做反转和Real-time PCR其实不用那么精确的定量吧？
agilent RNA 更多情况是用于检测RNA的完整性，RIN值。
根据实验室情况选择一种合适的定量方法再加上自己或师兄师姐们的经验就好了。 因为不同仪器定量结果是不 ...

主要原因是我买的反转录试剂盒规定每20 ul反应体系不超过1 ug RNA，而如果加入RNA较少的话，可能低丰度基因不容易检测或者扩增。而RNA过多，可能反转录又不好，所以适当确定RNA的浓度还是比较重要的。最近刚开始，不懂的地方很多，请多赐教！
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9楼2012-01-11 01:42:16
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longrna

新虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
俺的反转录试剂盒也是“规定”20ul体系用1ug的RNA，我按此“规定”反转了三次，均取1ul稀释20倍然后用1ul作模板扩PCR(25-30cycles)，结果无条带。
然后向其他师兄姐取经，他们平时反转用3ug的RNA，然后我按其一试，再取1ul稀释20倍然后用1ul作模板扩PCR，有条带。实验完成。
以上纯属俺个人经验，如有雷同，纯属巧合....
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10楼2012-01-11 09:58:13
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简单回复
bear201311楼
2015-10-10 22:21   回复  
引用回帖:
6楼: Originally posted by longrna at 2011-12-30 09:28:33 两种不同的检测方法（NanoDrop\aglient 2100）的确得出的结果不一样。 我也试过出来楼主这种情况。一般来说2100比nanodrop高一些，某次高一半，有时高10-30% 另外，aglient RNA 6000 nano kit不是检测25-500ng/ul ...

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