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zsdk

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR跑不出目的片段

用beacon designer7.9设计了4对引物，分2次送出合成。就是跑不出片段。片段大分别是：571、699、626、652bp。 我换了DEPC水，重新提了RNA，跑了温度梯度，引物梯度，模板梯度，还用他人用的正常的cDNA跑，都不行，没有目得片段，但有引物二聚体。内参-action能跑出来，很亮，测了提取的RNA OD值，各项正常。  我跑的基因mRNA序列2525bp，有3个外显子，CDS区在第三个外显子里，前两个外显子片段很短，共388bp。我设计的引物上游在前两个外显子里，下游在第三个外显子里。另外，我开始在CDS区（第三个外显子里）设计的引物都跑出来了，很好。   引物稀释没问题，我跟内参一起稀释的，并且我有2管，都稀释了，都泡了PCR。


引物各种参数都正常，软件评分都很高。就是有的个别引物的错配有点高，但3和5端没有错配。

[ Last edited by zsdk on 2011-5-19 at 09:31 ]
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1楼 2011-05-19 09:29:16
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

不懂帮顶、、、、
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-05-19 11:56:45
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

zsdk(金币+4): 谢谢答复 2011-05-19 14:16:58
这种情况大多是引物设计的不够好，甚至是不好。
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3楼2011-05-19 13:52:32
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xwsooo

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1949stone(金币+3): 貌似 2011-05-19 18:02:26
我自身体会是引物的特异性比在软件上的评分要重要的多，还是blast下吧，可以减少浪费时间~~~
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4楼2011-05-19 14:20:10
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金币+5): 同意 2011-05-19 18:02:38
zsdk(金币+4): 2011-05-21 20:05:02
actin能跑出来，说明cDNA没问题，之前的反转录以及RNA提取也没问题。考虑引物设计的问题吧。

引物设计一般都设计成没有错配的（软件分析结果），你这个是有特殊用处吗？
你PCR是用来做什么的？扩增基因，还是荧光定量PCR或者别的？

[ Last edited by 西瓜 on 2011-5-21 at 22:13 ]
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5楼2011-05-19 16:34:38
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zsdk

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-19 16:34:38:
actin能跑出来，说明cDNA没问题，之前的反转录以及RNA提取也没问题。考虑引物设计的问题吧。
你看看有没有可能是引物设计在两个外显子的交界处了，即：同一条引物的3‘端在外显子A上，5’端在外显子B上。这样的话 ...

我要外显子交界处的片段序列，然后和NCBI比对，最后做实时定量pcr
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6楼2011-05-21 20:04:54
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
1949stone: 要扣金币啊 吼吼 2011-05-22 11:51:11
引用回帖:
Originally posted by zsdk at 2011-05-21 20:04:54:
我要外显子交界处的片段序列，然后和NCBI比对，最后做实时定量pcr

不好意思，我脑袋短路了，居然以为你是用基因组DNA去扩增了……
前面我的回答里关于引物搭不上那番话你可以无视了
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7楼2011-05-21 22:15:37
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