应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR跑不出目的片段
71/1返回列表
查看: 2001  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zsdk

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR跑不出目的片段

用beacon designer7.9设计了4对引物，分2次送出合成。就是跑不出片段。片段大分别是：571、699、626、652bp。 我换了DEPC水，重新提了RNA，跑了温度梯度，引物梯度，模板梯度，还用他人用的正常的cDNA跑，都不行，没有目得片段，但有引物二聚体。内参-action能跑出来，很亮，测了提取的RNA OD值，各项正常。  我跑的基因mRNA序列2525bp，有3个外显子，CDS区在第三个外显子里，前两个外显子片段很短，共388bp。我设计的引物上游在前两个外显子里，下游在第三个外显子里。另外，我开始在CDS区（第三个外显子里）设计的引物都跑出来了，很好。   引物稀释没问题，我跟内参一起稀释的，并且我有2管，都稀释了，都泡了PCR。


引物各种参数都正常，软件评分都很高。就是有的个别引物的错配有点高，但3和5端没有错配。

[ Last edited by zsdk on 2011-5-19 at 09:31 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-05-19 09:29:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

不懂帮顶、、、、
赞一下 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-05-19 11:56:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

zsdk(金币+4): 谢谢答复 2011-05-19 14:16:58
这种情况大多是引物设计的不够好，甚至是不好。
赞一下 回复此楼
3楼2011-05-19 13:52:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xwsooo

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1949stone(金币+3): 貌似 2011-05-19 18:02:26
我自身体会是引物的特异性比在软件上的评分要重要的多，还是blast下吧，可以减少浪费时间~~~
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-05-19 14:20:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金币+5): 同意 2011-05-19 18:02:38
zsdk(金币+4): 2011-05-21 20:05:02
actin能跑出来，说明cDNA没问题，之前的反转录以及RNA提取也没问题。考虑引物设计的问题吧。

引物设计一般都设计成没有错配的（软件分析结果），你这个是有特殊用处吗？
你PCR是用来做什么的？扩增基因，还是荧光定量PCR或者别的？

[ Last edited by 西瓜 on 2011-5-21 at 22:13 ]
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-05-19 16:34:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zsdk

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-19 16:34:38:
actin能跑出来，说明cDNA没问题，之前的反转录以及RNA提取也没问题。考虑引物设计的问题吧。
你看看有没有可能是引物设计在两个外显子的交界处了，即：同一条引物的3‘端在外显子A上，5’端在外显子B上。这样的话 ...

我要外显子交界处的片段序列，然后和NCBI比对，最后做实时定量pcr
赞一下 回复此楼
6楼2011-05-21 20:04:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
1949stone: 要扣金币啊 吼吼 2011-05-22 11:51:11
引用回帖:
Originally posted by zsdk at 2011-05-21 20:04:54:
我要外显子交界处的片段序列，然后和NCBI比对，最后做实时定量pcr

不好意思，我脑袋短路了，居然以为你是用基因组DNA去扩增了……
前面我的回答里关于引物搭不上那番话你可以无视了
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2011-05-21 22:15:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zsdk 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭