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fengjuanLv

铜虫 (初入文坛)

[求助] RT-PCR没做出来，求指点

我是做棉花纤维的，提取的RNA质量还行，OD比值在1.8-2.0左右，RNA跑电泳时只有两条带，5s没有（但实验室其他人也是只有两条带）。反转录管家基因的时候只有一部分有RT产物，现在找不出原因，请各位盆友指教一下，在哪些方面可能存在问题。（有RT产物的都是天数很小的幼嫩组织，天数稍大的都没有，但是RNA浓度并不比幼嫩组织小，为什么？）本人真的很着急，感谢大家的帮忙！
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fengjuanLv

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期冀云淡风轻的日子
1楼2011-06-07 21:22:05
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szylnl

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励 2011-06-08 10:19:39
你是用oligo d(T)做的反转录引物吗？不行的话，可以试试用NNNNNN随机引物，做一下反转录。
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用百分之百的努力去做每件事
2楼2011-06-08 08:51:02
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fengjuanLv

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
是的，但是实验室之前有人做过，就是用的oligo(dT)，不知道为什么我没做出来，我现在也在尝试其他的方法，谢谢
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期冀云淡风轻的日子
3楼2011-06-08 10:25:25
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szylnl

银虫 (小有名气)
是不是引物本身的问题啊
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用百分之百的努力去做每件事
4楼2011-06-08 10:59:19
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-08 19:02:53
从你说的情况来看，RNA应该提取的非常成功，但是不能得到你的目的片段的话有以下几个考虑：
1.你反转录部分出现问题，导致反转录出的cDNA不是很完整，或者说效果不好，无法获得你的目的片段。管家基因并不能说明问题吧，因为一般情况下都很小
2.因为你说幼嫩组织可以获得管家基因，天数稍大的都没有，这说明，很可能你燿的基因只在幼嫩组织中表达，一旦时间过久，就不会有该基因表达。
因此，建议：
1.把你反转录的cDNA跑个电泳就，看是不是很均匀的一个拖尾，而且这个拖尾有没有覆盖到你的目的片段大小
2.再往前取天数更小的幼嫩组织，看会不会获得更好的结果。
好运，欢迎随时反馈交流
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5楼2011-06-08 14:33:00
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