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zsdk

新虫 (初入文坛)

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[求助] PCR跑不出目的片段

用beacon designer7.9设计了4对引物，分2次送出合成。就是跑不出片段。片段大分别是：571、699、626、652bp。我换了DEPC水，重新提了RNA，跑了温度梯度，引物梯度，模板梯度，还用他人用的正常的cDNA跑，都不行，没有目得片段，但有引物二聚体。内参-action能跑出来，很亮，测了提取的RNA OD值，各项正常。我跑的基因mRNA序列2525bp，有3个外显子，CDS区在第三个外显子里，前两个外显子片段很短，共388bp。我设计的引物上游在前两个外显子里，下游在第三个外显子里。另外，我开始在CDS区（第三个外显子里）设计的引物都跑出来了，很好。引物稀释没问题，我跟内参一起稀释的，并且我有2管，都稀释了，都泡了PCR。

引物各种参数都正常，软件评分都很高。就是有的个别引物的错配有点高，但3和5端没有错配。

[ Last edited by zsdk on 2011-5-19 at 09:31 ]

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1楼2011-05-19 09:29:16

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西瓜

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金币+5): 同意 2011-05-19 18:02:38
zsdk(金币+4): 2011-05-21 20:05:02

actin能跑出来，说明cDNA没问题，之前的反转录以及RNA提取也没问题。考虑引物设计的问题吧。

引物设计一般都设计成没有错配的（软件分析结果），你这个是有特殊用处吗？
你PCR是用来做什么的？扩增基因，还是荧光定量PCR或者别的？

[ Last edited by 西瓜 on 2011-5-21 at 22:13 ]