| 查看: 2024 | 回复: 6 | |||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||
jeavy2008
|
[求助]
未知基因片段的钓取讨论，恳请大家帮我分析分析
|
||
|
本人钓取的是高原鼠兔HMG-CoA还原酶（胆固醇合成关键酶）的cDNA序列，已经做了3,4个月了，一直毫无结果。实验流程如下：采样----提RNA----逆转录-----PCR。 一，采样。 采样地区实验条件受限制，只有-20度的冰箱，因此没办法只好取完肝脏剪碎放入RNA保护液里，然后再放入-20度冰箱。所有样品采完后用冰盒运送到实验室，中间大概有2天不到的时间，回来后全部解冻了，冰盒估计10几度的样子。不过这样本人感觉RNA应该不会降解很严重，RNA保护液上说-20度可以保持3个月，25度保存1-2周，试剂为国产试剂，再差应该不可能全部降解。 二，RNA提取 买的提取液提取的，所有操作与要用的试剂仪器等都有过用DEPC处理，先是买的索莱宝的（国产试剂，质量差，老板省钱要找便宜的买），没出条带。后来买的上海生工的，依然没出条带。最后买了百泰克的RNA组织提取液才提出来，OD260/280 1.8-1.99。条带不是很清楚，但是可以清楚看到有两条带，但是18:28没有1:2，大多情况下只有1:1，有时候还2:1.图片见于附件，有几张比较好的没传上去。 三，逆转录 这一步是用试剂盒的，用的百泰克的cDNA一步法合成的。合成的总体系是20ul，没有稀释直接做模板，为了验证cDNA合成是否成功，本人跑过胶，也跑过内参。胶呈smear，内参有条带，都是很亮的。这证明cDNA这步应该没啥问题。 四，PCR 这一步就是最关键了，本人设计了4对引物，1对从文献上找的，人家是做小鼠的。两对是在cDNA的 CDS序列两端设计的，取的相对保守的区域设计的（这两对刚学会设计引物时设计的，估计PCR产物太长而且引物也不太好，PCR产物2600BP），条带没出。后来我比对了几种动物的cDNA序列，大小鼠，人，兔子，黑猩猩，金黄地鼠。找到他们的cDNA相同的地方，用PP5.0设计了一对分数93分的引物，3‘端取的是严格保守区，就是几种动物一致的地方，5’端有1到两个碱基不是最保守的，产物1000BP多点，Tm一个52度，一个54度，从45到55进行梯度PCR也没出条带。这三对引物试了近半个月，换了几十次模板和条件都一直没出结果。最后一对是文献上的，有目的条带，条带比较暗，PCR产物送去测序没成功说浓度不够，后来没办法就做了下TA克隆，测序回来是假阳性(附件中菌液测序是双向测序没拼接的，其他两个是用菌液做的PCR出的产物测序结果)，都不是我的那种酶的基因。最杯具的发生了，偶然做了下空白，结果发现空白也有条带，而且和第四对引物的位置一样，刚开始以为是污染，就所有试剂什么的全换了，结果空白还是有条带，而且跟目的条带一个位置。最后怀疑是不是百泰克的酶有问题，换了TAKARA的RTAQ酶，这下一跑PCR，第四对引物也没有条带，自此证明第四条引物为假阳性，扩增的是TAG酶里面的大肠杆菌基因组的一个片段，和我目的片段非常相似，460BP左右。没办法，只有从新设计引物。现在引物正在合成中。 本人大概的实验流程就这样了，附件附有所有的实验图与引物和在NCBI里查的cDNA序列。恳请哪位高人帮我看看到底是哪出问题了？再恳请大家是否能依照附件的序列帮我设计一些好的引物，或者是简并引物。 谢谢大家！祝大家实验成功，天天开心。 附件下载地址：http://www.rayfile.com/files/5e6 ... -b91c-0015c55db73d/ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有252人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有7人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- DNA电泳图，奇怪的条带，大家帮我解解惑分析下吧
已经有7人回复
- 请大家帮我看个红外分析，可能有哪些基团
已经有6人回复
- 质粒DNA提取成了这样，请大家帮忙分析一下
已经有27人回复
- 急！急！求助！请大家帮我分析下为什么仅仅进样体积不一样，峰形就变了呢？！
已经有22人回复
- 环科院环境检测还是药物所药物分析？？大家帮帮我~
已经有7人回复
- 【求助】求大家帮我分析一下这张ESI质谱图
已经有34人回复
- 北京和深圳，哪个好呢？请大家帮我分析下
已经有28人回复
- 【求助/交流】举例说明模式生物中一个基因的序列的获取、序列分析和功能分析
已经有8人回复
- 【求助】希望大家帮我分析下原因
已经有10人回复
- 【求助/交流】如何确定未知基因编码氨基酸～
已经有8人回复
- 【交流】想考北京的分析化学或药物分析方面的博士研究生，请大家帮我推荐几个地方吧
已经有8人回复
- 【求助/交流】急求大家帮我分析一下我的基因组DNA电泳图
已经有3人回复
- 【求助/交流】RNA的提取问题和qRT-PCR分析基因在不同时间的定量表达
已经有10人回复
Arrennew
铁杆木虫 (正式写手)
- MolEPI: 4
- 应助: 19 (小学生)
- 金币: 7777.5
- 红花: 2
- 帖子: 301
- 在线: 122.9小时
- 虫号: 322853
- 注册: 2007-03-12
- 性别: GG
- 专业: 林木遗传育种学
2楼2011-07-04 22:05:17
gwbk
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 54
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2293.5
- 红花: 24
- 帖子: 529
- 在线: 186.9小时
- 虫号: 1320681
- 注册: 2011-06-11
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
3楼2011-07-04 23:02:47
jeavy2008 
捐助贵宾 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 3697.6
- 散金: 125
- 红花: 1
- 帖子: 134
- 在线: 19.9小时
- 虫号: 1330178
- 注册: 2011-06-24
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
4楼2011-07-05 12:55:16
jeavy2008
捐助贵宾 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 3697.6
- 散金: 125
- 红花: 1
- 帖子: 134
- 在线: 19.9小时
- 虫号: 1330178
- 注册: 2011-06-24
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
5楼2011-07-05 13:03:51
jeavy2008
捐助贵宾 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 3697.6
- 散金: 125
- 红花: 1
- 帖子: 134
- 在线: 19.9小时
- 虫号: 1330178
- 注册: 2011-06-24
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
6楼2011-07-06 10:33:52
lingonghua
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 4982
- 散金: 219
- 红花: 3
- 帖子: 738
- 在线: 466.5小时
- 虫号: 335478
- 注册: 2007-03-31
- 性别: GG
- 专业: 分子与进化生态学
7楼2011-08-06 17:09:49
