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shaquila金虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】如何确定未知基因编码氨基酸～已有2人参与
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目前在水稻中克隆到2个拟南芥和小麦同源基因（A，B功能相似）～～ 做了RACE拿到全长： A基因比对过拟南芥和小麦后，以及NCBI上的注释，编码区可以确定 B基因NCBI的注释基本就是错的，但与拟南芥和小麦的编码区比较后可以确定其保守结构，拟南芥中也存在两个相似功能基因，其中一个有信号肽，氨基酸序列较长～～ 这两个基因没有被克隆过，所以我无法确定其编码区，请问如何获得其确切的氨基酸编码区，如果要把两个基因提交到ncbi，是不是要确定其氨基酸编码区。以前做拟南芥相关基因的文章，是制备了抗体以后，进行杂交后，测得N端5个氨基酸序列，目前这个方法是否可行，另外抗体制备据说可以用蛋白质或者特异性的肽段，如果编码区未确定，把蛋白来制备抗体是不是不好？ 目前蛋白质测序好像都是用质谱，但蛋白点怎么分离，是不是用ELISA，有没有什么基础书籍推荐，图书馆最近搬迁，书都找不到了 另外，求几个基因预测或启动子预测软件和网站 本人对蛋白质技术是个菜鸟，望大家为我答疑解惑，不胜感激～～ |
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shaquila
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另补充下，现在课题进展到这个阶段，下一步怎么安排有点困惑～～ 我的目的是验证两个基因的功能，方法就是找突变体（用RiceGE找插入突变），找得到先做突变体，找不到直接转基因进行验证，但是我又怕序列只是预测的，怕出错，那就麻烦了～～ 有人建议我先得到蛋白质完整序列，这期间可以先培养材料，或者测定下酶活以及做做生理生化，但我感觉这样时间不够，做水稻转基因周期较长～～ 有人建议我可以先用拟南芥做材料转一下，看看表现如何，如果好的话，在转水稻～～ 目前很迷茫，实验室刚刚起步，蛋白质这块刚刚开始做，课题也是我自己找的，所以很多东西都要自己去找，但是很多方向性的问题也不敢自己做决定，没把握，希望大家提点意见和建议，谢谢～～ |
2楼2010-12-03 16:27:18
shaquila
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3楼2010-12-03 23:05:13
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2):good 2010-12-04 08:21:02
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dhd997(金币+2):good 2010-12-04 08:21:02
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Where did you get the sequence? from gDNA or cDNA? If you can get gDNA and cDNA of your gene, you can use some software to get the open reading frame from ATG---------TAA/TAG/TGA. If there is not intron, your gDNA sequence is enough for encoding region. |
4楼2010-12-04 00:49:38
★ ★ ★
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dhd997(金币+2):very good 2010-12-04 08:21:19
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dhd997(金币+2):very good 2010-12-04 08:21:19
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you also can do its locailzation by Agribacteria mediated tabacco otransformation or gene gun and do its over- expression or deletion in arabidopsis and if it is possible, you also can test its function in yeast these data are more indirect but it takes less time and energy more direct data should come from rice but i know it takes time to get knock out plants or overexpression plant good luck |
5楼2010-12-04 00:55:06
shaquila
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dhd997(金币+2):鼓励回帖交流 2010-12-06 08:26:47
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发了7，8个论坛，你是唯一回帖的，真是太感谢了 是cDNA序列，确切的是拿到了全长mRNA序列，UTR区和CDS，在线预测和同源比对，结果应该差不多了，但是不是有必要拿到准确的蛋白质序列呢，如果不拿到会不会被人质疑，那有什么方法拿到呢？ 其中有一个基因我预测了一下，前面有个信号肽结构，这个是不是在运输时候可能会被切掉，这样序列不是也无法确定，当然如果序列能拿到，即使是部分，通过三联体密码子3个3个向前推，最后可以确定ATG～～ 所以我想知道有没有什么通用的protocol，可以获得位置基因的编码区，谢谢～～ [ Last edited by shaquila on 2010-12-5 at 23:10 ] |
6楼2010-12-05 23:04:50
shaquila
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7楼2010-12-05 23:08:15
8楼2010-12-06 04:38:51
shaquila
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9楼2010-12-06 09:03:50