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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 未知基因片段的钓取讨论，恳请大家帮我分析分析
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jeavy2008

捐助贵宾 (小有名气)

[求助] 未知基因片段的钓取讨论，恳请大家帮我分析分析

本人钓取的是高原鼠兔HMG-CoA还原酶（胆固醇合成关键酶）的cDNA序列，已经做了3,4个月了，一直毫无结果。实验流程如下：采样----提RNA----逆转录-----PCR。
一，采样。
    采样地区实验条件受限制，只有-20度的冰箱，因此没办法只好取完肝脏剪碎放入RNA保护液里，然后再放入-20度冰箱。所有样品采完后用冰盒运送到实验室，中间大概有2天不到的时间，回来后全部解冻了，冰盒估计10几度的样子。不过这样本人感觉RNA应该不会降解很严重，RNA保护液上说-20度可以保持3个月，25度保存1-2周，试剂为国产试剂，再差应该不可能全部降解。
二，RNA提取
    买的提取液提取的，所有操作与要用的试剂仪器等都有过用DEPC处理，先是买的索莱宝的（国产试剂，质量差，老板省钱要找便宜的买），没出条带。后来买的上海生工的，依然没出条带。最后买了百泰克的RNA组织提取液才提出来，OD260/280 1.8-1.99。条带不是很清楚，但是可以清楚看到有两条带，但是18:28没有1:2，大多情况下只有1:1，有时候还2:1.图片见于附件，有几张比较好的没传上去。
三，逆转录
    这一步是用试剂盒的，用的百泰克的cDNA一步法合成的。合成的总体系是20ul，没有稀释直接做模板，为了验证cDNA合成是否成功，本人跑过胶，也跑过内参。胶呈smear，内参有条带，都是很亮的。这证明cDNA这步应该没啥问题。
四，PCR
    这一步就是最关键了，本人设计了4对引物，1对从文献上找的，人家是做小鼠的。两对是在cDNA的 CDS序列两端设计的，取的相对保守的区域设计的（这两对刚学会设计引物时设计的，估计PCR产物太长而且引物也不太好，PCR产物2600BP），条带没出。后来我比对了几种动物的cDNA序列，大小鼠，人，兔子，黑猩猩，金黄地鼠。找到他们的cDNA相同的地方，用PP5.0设计了一对分数93分的引物，3‘端取的是严格保守区，就是几种动物一致的地方，5’端有1到两个碱基不是最保守的，产物1000BP多点，Tm一个52度，一个54度，从45到55进行梯度PCR也没出条带。这三对引物试了近半个月，换了几十次模板和条件都一直没出结果。最后一对是文献上的，有目的条带，条带比较暗，PCR产物送去测序没成功说浓度不够，后来没办法就做了下TA克隆，测序回来是假阳性(附件中菌液测序是双向测序没拼接的，其他两个是用菌液做的PCR出的产物测序结果)，都不是我的那种酶的基因。最杯具的发生了，偶然做了下空白，结果发现空白也有条带，而且和第四对引物的位置一样，刚开始以为是污染，就所有试剂什么的全换了，结果空白还是有条带，而且跟目的条带一个位置。最后怀疑是不是百泰克的酶有问题，换了TAKARA的RTAQ酶，这下一跑PCR，第四对引物也没有条带，自此证明第四条引物为假阳性，扩增的是TAG酶里面的大肠杆菌基因组的一个片段，和我目的片段非常相似，460BP左右。没办法，只有从新设计引物。现在引物正在合成中。
本人大概的实验流程就这样了，附件附有所有的实验图与引物和在NCBI里查的cDNA序列。恳请哪位高人帮我看看到底是哪出问题了？再恳请大家是否能依照附件的序列帮我设计一些好的引物，或者是简并引物。 谢谢大家！祝大家实验成功，天天开心。
附件下载地址：http://www.rayfile.com/files/5e6 ... -b91c-0015c55db73d/
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1楼 2011-07-04 19:49:27
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lingonghua

铁杆木虫 (正式写手)
楼主，你是哪个单位的？我是西北高原生物研究所的，我们这有几个学生做高原鼠兔的，好像Race出来几个基因。会不会运送过程降解影响？我曾经帮人采过鸟类血液样品，装干冰里从西宁飞机送到深圳，据说和在西宁本地提取的几乎没有差别。
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7楼2011-08-06 17:09:49
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 很有经验！ 2011-07-05 00:44:31
jeavy2008(金币+1): 2011-07-05 13:04:21
我有一个片段设梯度不出，但Touchdown 出了，测序正确，不知为何，可以一试。 我建议从65度每个循环降1度至50度，然后50度25个循环。
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生命不息，探索不止。
2楼2011-07-04 22:05:17
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励应助 2011-07-05 00:44:55
jeavy2008(金币+1): 2011-07-05 13:04:32
看了楼主的引物资料，发现引物是以大鼠和小鼠为模板进行设计的。
但是高原鼠兔和兔子是近亲，和大鼠小鼠亲缘关系？为什么不多参考兔子DNA或者CDS序列为模板进行引物设计呢？

有目的条带的那一组直接溶液回收做模板，做一个二次PCR看看亮不亮。

做Touchdown也是不错的选择，Touchdown和梯度各有优点，可是尝试一下。
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3楼2011-07-04 23:02:47
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jeavy2008

捐助贵宾 (小有名气)
谢谢1楼的回答，我去试下看看。
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4楼2011-07-05 12:55:16
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