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PCR无任何条带，完全是空白胶
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我最近做PCR时，模板是基因组，电泳图除了Marker外，其他的一丁点条带都没有，完全是空白胶。我把所有体系全换新的，仍然没有，现在怀疑是引物问题，想验证下引物。打算用高浓度的琼脂胶（3%）来跑胶，能验证吗？  [ Last edited by 武荷花S on 2011-5-29 at 22:25 ] |
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凌波丽
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PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2 浓度：Mg2 离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 |
14楼2012-05-18 13:17:30
2楼2011-05-29 23:19:18
andy99990000
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【答案】应助回帖
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dhd997(金币+5, EPI+1): 很好 2011-05-30 08:28:39
武荷花S(金币+3): 2011-05-30 20:04:08
dhd997(金币+5, EPI+1): 很好 2011-05-30 08:28:39
武荷花S(金币+3): 2011-05-30 20:04:08
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楼主的图里有阴性对照吗？如果已包括的话，可以排除PCR体系污染的可能，那么很明显你的PCR没有正常工作，可能的原因很多，以个人经验，楼主可以尝试以下几个检测方法： 1. 用实验室一定工作的引物扩增你的DNA,这样能够看出除你的引物以外其他试剂是否工作正常。 2. 确定是引物的问题后还有2种可能： （1）你的PCR条件不适。按你的图来看，完全没工作，可以试试降低退火温度，做touchdown，或者增加Mg离子浓度及循环次数等。 （2）如果以上全试过还是不工作，那么很大程度上就是你的引物设计或者合成的问题了。解决方法就是重新设计或者合成，呵呵，废话了。 个人经验，希望有所帮助~~ |
3楼2011-05-30 00:23:51
4楼2011-05-30 01:42:39