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wangzhe163金虫 (小有名气)
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荧光定量PCR扩增效率低
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哪位高人在做相对荧光定量PCR？我最近在做标准曲线的时候遇到麻烦了，还请高人指点迷津啊。 在绘制标准曲线的时候，标准品是重组质粒，按10倍倍比稀释，取六个稀释度做标准线，R方能在0.99以上，但是扩增效率一直徘徊在55%-75%之间。  ，看网上说的解决办法：增加引物浓度，降低退火温度，改用三步法，（质粒线性化，我连的T-simple，这个载体上面应该有一个ECORV的酶切位点，但是我就是切不开 ）。这些方法我都试过了，引物也重新设计了sweat:，用的试剂是宝生物的SYBR，仪器是ABI 7500.小弟已困惑多日，请高人指点，在此谢过！ |
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路过ing 
2楼2013-01-21 10:44:50
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8楼2013-01-22 09:46:32
【答案】应助回帖
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wangzhe163: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-23 08:30:51
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wangzhe163: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-23 08:30:51
| 建议你用hindIII切一下线性化质粒，部分材料上说质粒的形态会影响扩增的效率。另外，今年AEM今年有篇文章专门讨论定量扩增效率的，建议你看一下，我阅读的结论是只要有合适的分析方法，没有必要过分纠结于扩增效率，文章地址如下：http://aem.asm.org/content/early/2012/04/02/AEM.07878-11.short |
9楼2013-01-22 10:37:55
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