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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR扩增效率低
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wangzhe163

金虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR扩增效率低

哪位高人在做相对荧光定量PCR？我最近在做标准曲线的时候遇到麻烦了，还请高人指点迷津啊。
    在绘制标准曲线的时候，标准品是重组质粒，按10倍倍比稀释，取六个稀释度做标准线，R方能在0.99以上，但是扩增效率一直徘徊在55%-75%之间。，看网上说的解决办法：增加引物浓度，降低退火温度，改用三步法，（质粒线性化，我连的T-simple，这个载体上面应该有一个ECORV的酶切位点，但是我就是切不开）。这些方法我都试过了，引物也重新设计了sweat:，用的试剂是宝生物的SYBR，仪器是ABI 7500.
    小弟已困惑多日，请高人指点，在此谢过！
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1楼 2013-01-21 10:14:34
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by wangzhe163 at 2013-01-22 09:22:32
这个我也不是太清楚啊...

你有载体和所用质粒的map或者序列吧，查一下酶切位点就可以了。
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8楼2013-01-22 09:46:32
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czfscf

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得 可能是人品的问题 或者天气不好吧 哈哈  路过ing
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Ecological Genomics；the scientific walking hormone
2楼2013-01-21 10:44:50
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是试剂出问题了，换换PCR mix试试
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3楼2013-01-21 10:55:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
T-simple的EcoRV不是T接头的位置吗？如果克隆片段进去后就没有这个酶切位点了。
赞一下 回复此楼
4楼2013-01-21 11:19:09
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查看全部 17 个回答
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