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然-然

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助PCR扩增试验遇到的问题?

引物:27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
       1492r:TACGGYTACCTTGTTACGACTT
反应体系:94℃ 2min(94℃ 1min,60℃ 1min,72℃ 90s)30循环,72℃ 10min,保温4℃。
大板的那个是一次电泳图片,小的是二次PCR电泳图片,我想送出去测序,总说我的样品浓度太低,请求各位大侠的指导。
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Hazel张健

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+3, 鼓励发帖积极交流。 2013-11-08 08:25:20
然-然: 金币+3 2013-11-18 15:23:22
你的marker是?!貌似你的PCR产物不是单一条带哦~对图片再多给点信息~
2楼2013-11-07 21:32:32
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562190113

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-08 10:47:06
然-然: 金币+2, 有帮助 2013-11-12 10:45:17
你可以把DNA重新沉淀啊,这样DNA就还原了。加dd水溶解的时候可以少加点dd水。这样DNA浓度就增大了。扩增效果应该明显一点。还有就是配体系的时候用枪加的量一定要够。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2013-11-08 00:51:03
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Lovebirdshs

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议使用巢式PCR扩增,应该能够大幅提高目的片段产量
孤独的舞者
11楼2013-11-10 19:59:36
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笨熊zhou

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
浓度太低会不会是回收率太低了,也就是试剂盒是不是不太适合,建议换试剂盒试试
每天对着镜子开心一笑
12楼2013-11-10 20:19:53
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普通回帖

然-然

铜虫 (初入文坛)

非常感谢你的回答,我的这两个图片都没有mark,都是样品的,我以前做过有mark的,我现在做是想送出去测序,但是条带越来越暗了,送出去的结果回来说样品浓度太低,共送出去13个样,出来了6个,其余的7个都没出来,反应体系25μl,上游引物(10μM):0.5μl,下游引物(10μM):0.5μl,无菌水13μl,预混液10μl
3楼2013-11-07 21:46:37
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562190113

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2013-11-08 08:25:40
你的俩个引物都是细菌通用引物。应该是做微生物的吧。我本科的实验就用这两个引物。其实,你也可以用PA PB试试的。虽然它是放线菌的引物。还有我想问你是塔里木大学张利莉院长的学生麽?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
5楼2013-11-08 00:57:19
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然-然

铜虫 (初入文坛)

我不是塔里木大学的学生,我是做微生物的。
6楼2013-11-08 08:22:05
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三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
问题是marker的信息太少,不过通过图像来看还不错,浓度应该挺好,没有marker怎么比对……上marker信息……
我不会!
7楼2013-11-08 09:47:15
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然-然

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 562190113 at 2013-11-08 00:51:03
你可以把DNA重新沉淀啊,这样DNA就还原了。加dd水溶解的时候可以少加点dd水。这样DNA浓度就增大了。扩增效果应该明显一点。还有就是配体系的时候用枪加的量一定要够。
...

你可以说的详细点吗
8楼2013-11-08 14:33:41
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sun_in_night

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-09 14:00:48
还有跑胶不加marker的啊。。。那你怎么知道跑出来的条带是你的要的大小?

PCR产物浓度小的话可以拿你的PCR产物作为模板再做一次PCR,这样能增加很多浓度。
9楼2013-11-09 12:23:18
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三蛰

铜虫 (小有名气)

同意楼上,这个没有marker,怎么判断所得到的条带就是你要的目的片段…………
我不会!
10楼2013-11-10 18:58:30
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