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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助PCR扩增试验遇到的问题？
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然-然

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助PCR扩增试验遇到的问题？

引物：27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
       1492r:TACGGYTACCTTGTTACGACTT
反应体系：94℃ 2min（94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 90s）30循环，72℃ 10min，保温4℃。
大板的那个是一次电泳图片，小的是二次PCR电泳图片，我想送出去测序，总说我的样品浓度太低，请求各位大侠的指导。
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1楼 2013-11-07 21:00:13
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Hazel张健

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+3, 鼓励发帖积极交流。 2013-11-08 08:25:20
然-然: 金币+3 2013-11-18 15:23:22
你的marker是？！貌似你的PCR产物不是单一条带哦~对图片再多给点信息~
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2楼2013-11-07 21:32:32
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562190113

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-08 10:47:06
然-然: 金币+2, ★有帮助 2013-11-12 10:45:17
你可以把DNA重新沉淀啊，这样DNA就还原了。加dd水溶解的时候可以少加点dd水。这样DNA浓度就增大了。扩增效果应该明显一点。还有就是配体系的时候用枪加的量一定要够。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2013-11-08 00:51:03
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Lovebirdshs

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议使用巢式PCR扩增，应该能够大幅提高目的片段产量
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孤独的舞者
11楼2013-11-10 19:59:36
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笨熊zhou

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
浓度太低会不会是回收率太低了，也就是试剂盒是不是不太适合，建议换试剂盒试试
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每天对着镜子开心一笑
12楼2013-11-10 20:19:53
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普通回帖

然-然

铜虫 (初入文坛)
非常感谢你的回答，我的这两个图片都没有mark，都是样品的，我以前做过有mark的，我现在做是想送出去测序，但是条带越来越暗了，送出去的结果回来说样品浓度太低，共送出去13个样，出来了6个，其余的7个都没出来，反应体系25μl，上游引物（10μM)：0.5μl，下游引物（10μM)：0.5μl，无菌水13μl，预混液10μl
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3楼2013-11-07 21:46:37
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562190113

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2013-11-08 08:25:40
你的俩个引物都是细菌通用引物。应该是做微生物的吧。我本科的实验就用这两个引物。其实，你也可以用PA PB试试的。虽然它是放线菌的引物。还有我想问你是塔里木大学张利莉院长的学生麽？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2013-11-08 00:57:19
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然-然

铜虫 (初入文坛)
我不是塔里木大学的学生，我是做微生物的。
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6楼2013-11-08 08:22:05
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三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
问题是marker的信息太少，不过通过图像来看还不错，浓度应该挺好，没有marker怎么比对……上marker信息……
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我不会！
7楼2013-11-08 09:47:15
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然-然

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 562190113 at 2013-11-08 00:51:03
你可以把DNA重新沉淀啊，这样DNA就还原了。加dd水溶解的时候可以少加点dd水。这样DNA浓度就增大了。扩增效果应该明显一点。还有就是配体系的时候用枪加的量一定要够。
...

你可以说的详细点吗
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8楼2013-11-08 14:33:41
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sun_in_night

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-09 14:00:48
还有跑胶不加marker的啊。。。那你怎么知道跑出来的条带是你的要的大小？

PCR产物浓度小的话可以拿你的PCR产物作为模板再做一次PCR，这样能增加很多浓度。
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9楼2013-11-09 12:23:18
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三蛰

铜虫 (小有名气)
同意楼上，这个没有marker，怎么判断所得到的条带就是你要的目的片段…………
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我不会！
10楼2013-11-10 18:58:30
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