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love_st

金虫 (著名写手)


[交流] 【求助/交流】荧光PCR扩增曲线问题

我的一对引物探针,高浓度的扩增没有问题,而低浓度却扩增不好,荧光信号很低,为什么?图中那两条扩增曲线是模板浓度十倍稀释的!请大家帮我看看哦!
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love_st(金币+7):谢谢,我想改变下引物或许有好的结果 2010-12-09 15:39:13
引用回帖:
Originally posted by love_st at 2010-12-09 11:44:35:

ABI7500的,染料是FAM,荧光值和模板浓度一般也是会呈现梯度下降的,这个下降的太多了,所以图形很难看,我想知道或者想讨论的是,什么因素导致低浓度的扩增效率不高,我想可能是我的引物本身的问题,那么能否改 ...

低浓度模板扩增效率问题是一个普遍的现象,和引物质量有直接关系

1,不管有没有扩增出目的片段,只要里边有模板,从第一个循环开始就会消耗引物,而且模板越多越复杂,消耗就越大,基因组远大于质粒的消耗。这样30个循环下来就消耗了大量的引物,越往后效率越低是难免的

2,引物的初始浓度也不能太高了,太高了就会增加非特异性和二聚体等杂带

3,如果引物本身的质量不是特别好,经过30轮的折腾,里边难免会形成一些引物自身的二级结构导致引物序列的改变(taq酶是很厉害的,只要有一点点的机会,他也能给你往上添加碱基。这个你应该可以理解)

所以,以上三点不难看出,为什么大家都知道低浓度模板扩增效果差,却无法解决了

貌似你的问题如果想彻底解决,推荐换一对更好的引物。

不过半对数的图也行会更好

个人观点
9楼2010-12-09 15:10:04
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love_st(金币+1):谢谢交流 2010-12-09 08:59:09
做了几个复孔啊, 第二条明显不对啊
3楼2010-12-09 08:50:27
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love_st

金虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-12-09 08:50:27:
做了几个复孔啊, 第二条明显不对啊

做了很多重复,这对引物探针就是这样,高浓度的模板扩增挺好,就是低浓度的模板突然不呈梯度的荧光信号突然下降的厉害,体系优化似乎也优化不出来
4楼2010-12-09 08:58:53
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最好还是多些数据,两条线不太好分析啊

[ Last edited by silicare on 2010-12-9 at 09:50 ]
5楼2010-12-09 10:32:21
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