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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 实时荧光定量PCR，但扩增曲线没有平台期！！
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pksq100056

木虫 (正式写手)

[求助] 实时荧光定量PCR，但扩增曲线没有平台期！！ 已有3人参与

最近在跑实时荧光定量PCR，但扩增曲线没有平台期，郁闷啊，溶解曲线还不错啊！求分析原因，谢谢各位大神了！！！！
实时荧光定量PCR，但扩增曲线没有平台期！！
aki gi.jpg


实时荧光定量PCR，但扩增曲线没有平台期！！-1
aki kuozeng.jpg
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1楼 2013-09-11 12:57:54
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

holyala

木虫 (著名写手)

砖家

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-14 09:00:24
模板量倒不觉得太高，毕竟Ct值在22-30也算是正常的，引物或者dNTP过量倒是比较有可能。
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7楼2013-09-13 16:47:51
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-14 09:00:28
从扩增曲线看，很有可能是用探针做的，探针设计不合理的有可能出现这种情况。如果是探针，可检查探针问题。
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8楼2013-09-13 17:15:30
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普通回帖

love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-11 16:59:46
扩增很差，无S型扩展曲线，是不是你的东西过量了
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2楼2013-09-11 13:51:37
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pksq100056

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2013-09-11 13:51:37
扩增很差，无S型扩展曲线，是不是你的东西过量了

模板的浓度太高了？
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3楼2013-09-11 16:10:37
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-11 19:30:47
引用回帖:
3楼: Originally posted by pksq100056 at 2013-09-11 16:10:37
模板的浓度太高了？...

可能引物，镁离子，酶、dntps浓度过高都有可能，
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4楼2013-09-11 16:47:36
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beyond0551

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
底物过量，无S型扩展曲线，建议再做一次吧
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无悔青春
5楼2013-09-13 10:30:48
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-14 09:00:17
溶解曲线还行，但是扩增曲线不行，很直接的问题就是扩增效率的问题。
造成扩增效率低的原因：模板量低，退火温度高，引物浓度等。

多问一句你是用探针还是荧光染料？

减少模板量个人认为不可取。
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6楼2013-09-13 14:12:01
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pksq100056

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by reallpf at 2013-09-13 14:12:01
溶解曲线还行，但是扩增曲线不行，很直接的问题就是扩增效率的问题。
造成扩增效率低的原因：模板量低，退火温度高，引物浓度等。

多问一句你是用探针还是荧光染料？

减少模板量个人认为不可取。

我用的是SYBR-Green！
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9楼2013-09-14 08:22:46
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pksq100056

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by holyala at 2013-09-13 16:47:51
模板量倒不觉得太高，毕竟Ct值在22-30也算是正常的，引物或者dNTP过量倒是比较有可能。

我引物上下游加起来一共是1ul，总体积是20ul，多吗？
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10楼2013-09-14 08:24:18
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