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pksq100056

木虫 (正式写手)

[求助] 实时荧光定量PCR,但扩增曲线没有平台期!! 已有3人参与

最近在跑实时荧光定量PCR,但扩增曲线没有平台期,郁闷啊,溶解曲线还不错啊!求分析原因,谢谢各位大神了!!!!
实时荧光定量PCR,但扩增曲线没有平台期!!
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实时荧光定量PCR,但扩增曲线没有平台期!!-1
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-14 09:00:24
模板量倒不觉得太高,毕竟Ct值在22-30也算是正常的,引物或者dNTP过量倒是比较有可能。
7楼2013-09-13 16:47:51
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-14 09:00:28
从扩增曲线看,很有可能是用探针做的,探针设计不合理的有可能出现这种情况。如果是探针,可检查探针问题。
8楼2013-09-13 17:15:30
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普通回帖

love_st

金虫 (著名写手)


【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-09-11 16:59:46
扩增很差,无S型扩展曲线,是不是你的东西过量了
2楼2013-09-11 13:51:37
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pksq100056

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2013-09-11 13:51:37
扩增很差,无S型扩展曲线,是不是你的东西过量了

模板的浓度太高了?
3楼2013-09-11 16:10:37
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love_st

金虫 (著名写手)


【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-09-11 19:30:47
引用回帖:
3楼: Originally posted by pksq100056 at 2013-09-11 16:10:37
模板的浓度太高了?...

可能引物,镁离子,酶、dntps浓度过高都有可能,
4楼2013-09-11 16:47:36
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beyond0551

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
底物过量,无S型扩展曲线,建议再做一次吧
无悔青春
5楼2013-09-13 10:30:48
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-14 09:00:17
溶解曲线还行,但是扩增曲线不行,很直接的问题就是扩增效率的问题。
造成扩增效率低的原因:模板量低,退火温度高,引物浓度等。

多问一句你是用探针还是荧光染料?

减少模板量个人认为不可取。
6楼2013-09-13 14:12:01
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pksq100056

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by reallpf at 2013-09-13 14:12:01
溶解曲线还行,但是扩增曲线不行,很直接的问题就是扩增效率的问题。
造成扩增效率低的原因:模板量低,退火温度高,引物浓度等。

多问一句你是用探针还是荧光染料?

减少模板量个人认为不可取。

我用的是SYBR-Green!
9楼2013-09-14 08:22:46
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pksq100056

木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by holyala at 2013-09-13 16:47:51
模板量倒不觉得太高,毕竟Ct值在22-30也算是正常的,引物或者dNTP过量倒是比较有可能。

我引物上下游加起来一共是1ul,总体积是20ul,多吗?
10楼2013-09-14 08:24:18
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