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wangweijian

金虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR曲线上翘,没达到平台期

荧光定量PCR,体系优化后,曲线上翘,没有达到平台期,不知是什么原因。
40uL体系
DNA模板 2μL
dNTP(2.5mM) 3.2μL
10×buffer 4μL
引物   F(10μM)  1.2μL
            R (10μM) 1.2μL
荧光探针(10μm)  0.6μL
Taq酶(500U)  0.3μL
ddH2O  23.5μL
荧光定量PCR曲线上翘,没达到平台期
1.jpg
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
wangweijian: 金币+1, 有帮助 2013-07-23 12:00:57
可以加大循环数,增加起始模板量也可以降低Ct值。
2楼2013-07-15 14:13:10
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love_st

金虫 (著名写手)


【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wangweijian: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-07-23 12:01:26
扩增不是很好,荧光信号绝对增长量较低,没有达到平台期个人感觉是东西都够量,所以增加引物、探针的比值,可能可以出现平台。
3楼2013-07-15 14:51:02
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wangweijian

金虫 (小有名气)

模板量已经增加过,结果也差不多;如果扩增的好的话,40个循环够了的。这是优化了很久的结果,我个人是怀疑模板不对或者引物不对,但是又无法判断,真是纠结。我之前做的另外一个基因,根本不用优化,曲线就很好。
4楼2013-07-15 15:51:04
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real-time

至尊木虫 (著名写手)

Taq酶(500U)  0.3μL?
5U/ul吧

初步看是探针效果不是很好,信噪比低
一步法逆转录RNA多重实时荧光定量PCR课题服务QQ461749807
5楼2013-10-10 17:13:37
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