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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR曲线上翘，没达到平台期
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wangweijian

金虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR曲线上翘，没达到平台期

荧光定量PCR，体系优化后，曲线上翘，没有达到平台期，不知是什么原因。
40uL体系
DNA模板 2μL
dNTP(2.5mM) 3.2μL
10×buffer 4μL
引物   F(10μM)  1.2μL
            R (10μM) 1.2μL
荧光探针(10μm)  0.6μL
Taq酶(500U)  0.3μL
ddH2O  23.5μL
荧光定量PCR曲线上翘，没达到平台期
1.jpg
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1楼2013-07-15 12:57:09
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wangweijian

金虫 (小有名气)
模板量已经增加过，结果也差不多；如果扩增的好的话，40个循环够了的。这是优化了很久的结果，我个人是怀疑模板不对或者引物不对，但是又无法判断，真是纠结。我之前做的另外一个基因，根本不用优化，曲线就很好。
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4楼2013-07-15 15:51:04
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wangweijian: 金币+1, ★有帮助 2013-07-23 12:00:57
可以加大循环数，增加起始模板量也可以降低Ct值。
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2楼2013-07-15 14:13:10
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wangweijian: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-07-23 12:01:26
扩增不是很好，荧光信号绝对增长量较低，没有达到平台期个人感觉是东西都够量，所以增加引物、探针的比值，可能可以出现平台。
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3楼2013-07-15 14:51:02
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real-time

至尊木虫 (著名写手)
Taq酶(500U)  0.3μL？
5U/ul吧

初步看是探针效果不是很好，信噪比低
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一步法逆转录RNA多重实时荧光定量PCR课题服务QQ461749807
5楼2013-10-10 17:13:37
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