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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » taqman荧光定量PCR交流
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lxyconan

新虫 (初入文坛)

[交流] taqman荧光定量PCR交流

首先我先说明一下做实验的目的：要区分不同的基因型并且定量。在上海辉睿定的探针。引物不管是大浓度的dna还是小浓度都能跑出来，小浓度的能看到引物二聚体。并且也跑过梯度50到60条带亮度没有差别。小弟初接触荧光定量，经验不足，希望和大师们多交流一下。图片是荧光遇到的问题，最后的是对荧光产物进行电泳。
1、我感觉曲线有点儿趴(扩增曲线不趴，但是原始曲线很趴，没有明显的S型感觉)，有的时候57度可以跑出来，但是同时做的54 55的时候曲线上下抖动特别厉害，一直没有弄清楚什么原因，感觉温度越低ct值越小。
2、引物我跑过梯度，临床检测的102 左右浓度的样本， 50℃到60℃都能跑出来，55摄氏度之后的条带偏亮。做探针实验一直用的是＞108的样本，但是ct值比临床的要高(差至少一个数量级左右)，我怕弱阳性的标本检测不出来，以后做定量也受影响。
3、个人感觉探针的Tm值是不是太低了？导致的结合效率收到影响？是否有必要重新设计探针？或者用MGB探针
4、探针能不能靠近下游引物？
5、探针3端需不需要磷酸化，有时候有以探针为引物扩增出来非特异性条带
6、探针的5端 配对实验影响大不大？

图片1.png



图片2.png



图片3.png
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1楼 2013-05-06 11:25:46
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纯木木鱼

新虫 (初入文坛)
★
lxyconan(金币+1): 谢谢参与
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2楼2013-05-06 11:42:21
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love_st

金虫 (著名写手)
★ ★
lxyconan(金币+1): 谢谢参与
lxyconan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-06 12:22:41
感觉你的这对引物探针扩增很差，估计你得换探针了
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4楼2013-05-06 12:04:17
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纯木木鱼

新虫 (初入文坛)
★
lxyconan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-06 12:23:19
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5楼2013-05-06 12:04:20
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纯木木鱼

新虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
6楼2013-05-06 12:05:07
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lxyconan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 纯木木鱼 at 2013-05-06 12:05:07
在blast中核对探针序列~

我的引物blast过 没有特异的。 探针有错配，但是那一段离的比较远，应该不会扩增那一段。刚拿回来的探针扩增曲线的ct值接近临床成熟的试剂盒，但是原始曲线没有明显的S型，以前57 也能做出来重复性良好，但现在 曲线抖动的厉害
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7楼2013-05-06 12:17:18
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lxyconan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 纯木木鱼 at 2013-05-06 11:42:21
您好 我想问一下您用的是哪个公司的probe荧光定量试剂？

mix是生工的
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8楼2013-05-06 12:21:04
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love_st

金虫 (著名写手)
尝试自己配个mix又不难的了，或许自己配的比市场上的好，不过我还是觉得你的引物探针不行
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9楼2013-05-06 12:26:12
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lxyconan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 纯木木鱼 at 2013-05-06 12:04:20
您好！
    探针TM值一般为65-70℃，通常比引物高5-10℃。
    探针位置尽量靠近上游引物比较合适
    既然出现了非特异性条带，说明你的探针特异性不是很好，你可以将序列在t中核对一次，如果发现有非特异性互补 ...

我是扩增同一段，然后利用探针来区分，引物tm53.7，但实际上50 到60都能跑出来，几乎没有差异。探针我考虑到了snp位置，离下游引物近，我自然的以另外一条链设计探针，探针tm是64.7，G和C差不多相等，就是探针结合的不好，只用引物跑的话 不管高浓度还是低浓度都可以跑出来并且没有非特异性条带。blast我也试过，除了和目的基因100%匹配，和别的基因没有全部匹配的。
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10楼2013-05-06 12:39:02
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lxyconan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by love_st at 2013-05-06 12:04:17
感觉你的这对引物探针扩增很差，估计你得换探针了

我合成的时候专门让人看过了，他说理论上可行，比引物高至少5℃，snp位点就在那个区域，很限制，我就想想是不是用MGB探针的话会好些？
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11楼2013-05-06 12:41:51
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lxyconan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by love_st at 2013-05-06 12:26:12
尝试自己配个mix又不难的了，或许自己配的比市场上的好，不过我还是觉得你的引物探针不行

我试过，感觉没什么不一样，第一次就是自己配的，后来感觉做不出来了 才买的，我的引物跑普通的绝对没有问题，很亮，只是加了探针之后，发现亮度变暗，有时候探针没有信号，但是跑胶能出来，个人感觉也是探针设计是不是出现了问题。
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12楼2013-05-06 12:44:31
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纯木木鱼

新虫 (初入文坛)
★
lxyconan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-05-06 16:02:30
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13楼2013-05-06 12:53:47
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纯木木鱼

新虫 (初入文坛)
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14楼2013-05-06 12:59:46
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lxyconan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 纯木木鱼 at 2013-05-06 12:59:46
你是做SNP分型实验？

是的
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18楼2013-05-06 13:35:58
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lxyconan

新虫 (初入文坛)
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13楼: Originally posted by 纯木木鱼 at 2013-05-06 12:53:47
整条探针中碱基c的含量要高于G的含量。
实验具体是怎么回事有很多因素存在~也不一定是探针的问题。
考虑到探针合成价格的问题，要是样本不珍贵，建议你先先换下试剂在试试，说实话生工的试剂不敢恭维，你可以用一 ...

当时我考虑到c要明显大于G这点了 但是我和takara 和上海辉睿的工作人员询问过，他们说影响不大。我找找他们拿点儿试用装试试
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19楼2013-05-06 13:38:34
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纯木木鱼

新虫 (初入文坛)
★
lxyconan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-06 16:02:41
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20楼2013-05-06 13:41:48
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rggworld

木虫 (职业作家)
★
lxyconan(金币+1): 谢谢参与
祝楼主诸事顺利，万事如意！
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22楼2013-05-06 13:54:45
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假大空

木虫之王 (文学泰斗)
★
lxyconan(金币+1): 谢谢参与
??
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24楼2013-05-06 14:05:26
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 纯木木鱼 at 2013-05-06 12:53:47
整条探针中碱基c的含量要高于G的含量。
实验具体是怎么回事有很多因素存在~也不一定是探针的问题。
考虑到探针合成价格的问题，要是样本不珍贵，建议你先先换下试剂在试试，说实话生工的试剂不敢恭维，你可以用一 ...

你说的对，SNP本身限制的因素就很多，也可以尝试围绕这条探针进行引物设计，毕竟引物便宜点，但是我感觉类似这样的荧光曲线，恐怕很难改变，当然仁兄说的换体系或许也存在结果较好的情况，但是一对好的引物探针基本上对于市场上的mix是可以兼容的
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26楼2013-05-06 16:42:15
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黑胡子

新虫 (初入文坛)
★
lxyconan(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
27楼: Originally posted by yingying1588 at 2013-05-06 22:28:40

学习学习
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28楼2013-05-07 09:17:22
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ann花开花落

铜虫 (正式写手)
★
lxyconan(金币+1): 谢谢参与
你这是什么仪器啊 还是中文的  感觉界面还起来挺清楚地，咱的还得切换来切换去的，麻烦的很
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29楼2013-05-09 11:16:25
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1322324659

新虫 (小有名气)
★
lxyconan(金币+1): 谢谢参与
使用Taqman MGB探针进行基因突变的荧光定量检测，报告基团FAM，淬灭基团BHQ。
以10的7次方IU/ml质粒为模板，按1%~100%的比例稀释，但是曲线一直不成线性中间10%~20%这个比例的CT值一直比32%的小。
前后用了两个体系，一个自己配的，一个用的Taqman master mix。Taqman master mix曲线很好看，有按比例来，但是产物一直不多。自己配的就是上面说问题，由于实验需要，我只能用自己配的体系。

求前辈指导！！
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31楼2015-10-23 11:05:52
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冶金物理化学3楼
2013-05-06 11:59   回复  
lxyconan(金币+1): 谢谢参与
ldy8536799615楼
2013-05-06 13:10   回复  
lxyconan(金币+1): 谢谢参与
readytogo16楼
2013-05-06 13:19   回复  
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clarktao17楼
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seaskyzdw21楼
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yuxintian23楼
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yingying158827楼
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