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[交流]
taqman荧光定量PCR交流
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首先我先说明一下做实验的目的：要区分不同的基因型并且定量。在上海辉睿定的探针。引物不管是大浓度的dna还是小浓度都能跑出来，小浓度的能看到引物二聚体。并且也跑过梯度50到60条带亮度没有差别。小弟初接触荧光定量，经验不足，希望和大师们多交流一下。图片是荧光遇到的问题，最后的是对荧光产物进行电泳。 1、我感觉曲线有点儿趴(扩增曲线不趴，但是原始曲线很趴，没有明显的S型感觉)，有的时候57度可以跑出来，但是同时做的54 55的时候曲线上下抖动特别厉害，一直没有弄清楚什么原因，感觉温度越低ct值越小。 2、引物我跑过梯度，临床检测的102 左右浓度的样本， 50℃到60℃都能跑出来，55摄氏度之后的条带偏亮。做探针实验一直用的是＞108的样本，但是ct值比临床的要高(差至少一个数量级左右)，我怕弱阳性的标本检测不出来，以后做定量也受影响。 3、个人感觉探针的Tm值是不是太低了？导致的结合效率收到影响？是否有必要重新设计探针？或者用MGB探针 4、探针能不能靠近下游引物？ 5、探针3端需不需要磷酸化，有时候有以探针为引物扩增出来非特异性条带 6、探针的5端 配对实验影响大不大？  图片1.png  图片2.png  图片3.png |
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lxyconan(金币+1): 谢谢参与
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2楼2013-05-06 11:42:21
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lxyconan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-06 12:23:19
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