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lxyconan

新虫 (初入文坛)

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[交流] taqman荧光定量PCR交流

首先我先说明一下做实验的目的：要区分不同的基因型并且定量。在上海辉睿定的探针。引物不管是大浓度的dna还是小浓度都能跑出来，小浓度的能看到引物二聚体。并且也跑过梯度50到60条带亮度没有差别。小弟初接触荧光定量，经验不足，希望和大师们多交流一下。图片是荧光遇到的问题，最后的是对荧光产物进行电泳。
1、我感觉曲线有点儿趴(扩增曲线不趴，但是原始曲线很趴，没有明显的S型感觉)，有的时候57度可以跑出来，但是同时做的54 55的时候曲线上下抖动特别厉害，一直没有弄清楚什么原因，感觉温度越低ct值越小。
2、引物我跑过梯度，临床检测的102 左右浓度的样本， 50℃到60℃都能跑出来，55摄氏度之后的条带偏亮。做探针实验一直用的是＞108的样本，但是ct值比临床的要高(差至少一个数量级左右)，我怕弱阳性的标本检测不出来，以后做定量也受影响。
3、个人感觉探针的Tm值是不是太低了？导致的结合效率收到影响？是否有必要重新设计探针？或者用MGB探针
4、探针能不能靠近下游引物？
5、探针3端需不需要磷酸化，有时候有以探针为引物扩增出来非特异性条带
6、探针的5端配对实验影响大不大？

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1楼 2013-05-06 11:25:46

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love_st

金虫 (著名写手)

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引用回帖:

13楼: Originally posted by 纯木木鱼 at 2013-05-06 12:53:47
整条探针中碱基c的含量要高于G的含量。
实验具体是怎么回事有很多因素存在~也不一定是探针的问题。
考虑到探针合成价格的问题，要是样本不珍贵，建议你先先换下试剂在试试，说实话生工的试剂不敢恭维，你可以用一 ...

你说的对，SNP本身限制的因素就很多，也可以尝试围绕这条探针进行引物设计，毕竟引物便宜点，但是我感觉类似这样的荧光曲线，恐怕很难改变，当然仁兄说的换体系或许也存在结果较好的情况，但是一对好的引物探针基本上对于市场上的mix是可以兼容的