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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » taqman荧光定量PCR交流
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lxyconan

新虫 (初入文坛)

[交流] taqman荧光定量PCR交流

首先我先说明一下做实验的目的：要区分不同的基因型并且定量。在上海辉睿定的探针。引物不管是大浓度的dna还是小浓度都能跑出来，小浓度的能看到引物二聚体。并且也跑过梯度50到60条带亮度没有差别。小弟初接触荧光定量，经验不足，希望和大师们多交流一下。图片是荧光遇到的问题，最后的是对荧光产物进行电泳。
1、我感觉曲线有点儿趴(扩增曲线不趴，但是原始曲线很趴，没有明显的S型感觉)，有的时候57度可以跑出来，但是同时做的54 55的时候曲线上下抖动特别厉害，一直没有弄清楚什么原因，感觉温度越低ct值越小。
2、引物我跑过梯度，临床检测的102 左右浓度的样本， 50℃到60℃都能跑出来，55摄氏度之后的条带偏亮。做探针实验一直用的是＞108的样本，但是ct值比临床的要高(差至少一个数量级左右)，我怕弱阳性的标本检测不出来，以后做定量也受影响。
3、个人感觉探针的Tm值是不是太低了？导致的结合效率收到影响？是否有必要重新设计探针？或者用MGB探针
4、探针能不能靠近下游引物？
5、探针3端需不需要磷酸化，有时候有以探针为引物扩增出来非特异性条带
6、探针的5端 配对实验影响大不大？

图片1.png



图片2.png



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1楼 2013-05-06 11:25:46
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lxyconan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 纯木木鱼 at 2013-05-06 12:04:20
您好！
    探针TM值一般为65-70℃，通常比引物高5-10℃。
    探针位置尽量靠近上游引物比较合适
    既然出现了非特异性条带，说明你的探针特异性不是很好，你可以将序列在t中核对一次，如果发现有非特异性互补 ...

我是扩增同一段，然后利用探针来区分，引物tm53.7，但实际上50 到60都能跑出来，几乎没有差异。探针我考虑到了snp位置，离下游引物近，我自然的以另外一条链设计探针，探针tm是64.7，G和C差不多相等，就是探针结合的不好，只用引物跑的话 不管高浓度还是低浓度都可以跑出来并且没有非特异性条带。blast我也试过，除了和目的基因100%匹配，和别的基因没有全部匹配的。
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10楼2013-05-06 12:39:02
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纯木木鱼

新虫 (初入文坛)
★
lxyconan(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
2楼2013-05-06 11:42:21
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love_st

金虫 (著名写手)
★ ★
lxyconan(金币+1): 谢谢参与
lxyconan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-06 12:22:41
感觉你的这对引物探针扩增很差，估计你得换探针了
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4楼2013-05-06 12:04:17
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纯木木鱼

新虫 (初入文坛)
★
lxyconan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-06 12:23:19
本帖内容被屏蔽
5楼2013-05-06 12:04:20
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