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lxyconan

新虫 (初入文坛)

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[交流] taqman荧光定量PCR交流

首先我先说明一下做实验的目的：要区分不同的基因型并且定量。在上海辉睿定的探针。引物不管是大浓度的dna还是小浓度都能跑出来，小浓度的能看到引物二聚体。并且也跑过梯度50到60条带亮度没有差别。小弟初接触荧光定量，经验不足，希望和大师们多交流一下。图片是荧光遇到的问题，最后的是对荧光产物进行电泳。
1、我感觉曲线有点儿趴(扩增曲线不趴，但是原始曲线很趴，没有明显的S型感觉)，有的时候57度可以跑出来，但是同时做的54 55的时候曲线上下抖动特别厉害，一直没有弄清楚什么原因，感觉温度越低ct值越小。
2、引物我跑过梯度，临床检测的102 左右浓度的样本， 50℃到60℃都能跑出来，55摄氏度之后的条带偏亮。做探针实验一直用的是＞108的样本，但是ct值比临床的要高(差至少一个数量级左右)，我怕弱阳性的标本检测不出来，以后做定量也受影响。
3、个人感觉探针的Tm值是不是太低了？导致的结合效率收到影响？是否有必要重新设计探针？或者用MGB探针
4、探针能不能靠近下游引物？
5、探针3端需不需要磷酸化，有时候有以探针为引物扩增出来非特异性条带
6、探针的5端配对实验影响大不大？

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1楼2013-05-06 11:25:46

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lxyconan

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引用回帖:

5楼: Originally posted by 纯木木鱼 at 2013-05-06 12:04:20
您好！
探针TM值一般为65-70℃，通常比引物高5-10℃。
探针位置尽量靠近上游引物比较合适
既然出现了非特异性条带，说明你的探针特异性不是很好，你可以将序列在t中核对一次，如果发现有非特异性互补 ...

我是扩增同一段，然后利用探针来区分，引物tm53.7，但实际上50 到60都能跑出来，几乎没有差异。探针我考虑到了snp位置，离下游引物近，我自然的以另外一条链设计探针，探针tm是64.7，G和C差不多相等，就是探针结合的不好，只用引物跑的话不管高浓度还是低浓度都可以跑出来并且没有非特异性条带。blast我也试过，除了和目的基因100%匹配，和别的基因没有全部匹配的。